Overview

  • Livello costante e superiore di rendimento e purezza dell'RNA o dell'acido nucleico totale
  • Centrifugazione, filtrazione a vuoto o solventi non richiesti
  • Supporto di elaborazioni automatizzate o manuali

Applicazione: isolamento di RNA totale o di acido nucleico totale da campioni di tessuto FFPE
Tecniche di applicazione a valle: qRT-PCR, microarray

Panoramica del processo

A - B. Digestione del tessuto e rilascio di acidi nucleici. 1. Legame di acidi nucleici con biglie magnetiche 2. Separazione delle biglie 3. Lavaggio dei prodotti catturati con etanolo al 70% 4. Lavaggio con isopropanolo per la rimozione dei contaminanti 5. Lavaggio con etanolo al 70% 6. Eluizione di acidi nucleici dalle particelle magnetiche.

Recupero di acido nucleico frammentato

La fissazione dei campioni di tessuto in formaldeide potrebbe causare un'eccessiva reticolazione dei componenti del tessuto. La qualità di acido nucleico varia in base a numerosi fattori, tra cui le modalità di esecuzione del processo di fissazione in formalina, l'età del campione, le condizioni di conservazione e così via. Come illustrato nella figura 1, l'isolamento di acido nucleico da una vasta gamma di tipi e di età di campioni FFPE è stato eseguito mediante il processo Agencourt FormaPure e amplificato con successo attraverso la reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR).

Recupero di acido nucleico

Figura 1. L'acido nucleico totale è stato isolato da sezioni di 5 micron per ciascun tessuto. Il volume di eluizione era pari a 40 µl. Sono stati impiegati due (2) µl di prodotto eluito in una reazione PCR da 20 µl (45 cicli) allo scopo di amplificare una regione da 300 bp del gene GAPDH. Su un campione da 10 µl è stata eseguita l'elettroforesi su un gel di agarosio al 2%. La corsia 9 contiene il controllo negativo. La corsia 10 contiene una scala da 1 kb.

Purezza costante dell'RNA

Il sistema Agencourt FormaPure offre un livello costante di rendimento e di purezza dell'RNA. La Tabella 1 contiene i dati relativi all'RNA recuperato da cinque repliche biologiche di tessuto di polmone di ratto FFPE che sono state purificate mediante il metodo Agencourt FormaPure. Si osservano rapporti costanti compresi tra 1,79 e 1,83 per 260/280 e tra 1,06 e 1,21 per 260/230. Le tracce del bioanalizzatore Agilent* ricavate dagli stessi campioni mostrano un livello costante di purezza e di recupero dei frammenti dell'RNA (figura 2).

Tabella 1. Dati di siti beta per l'RNA purificato dai tessuti di polmoni di ratto FFPE mediante il metodo Agencourt FormaPure. Per ciascuna replica è stata utilizzata una sezione da 10 micron.

Purezza dell'RNA

Figura 2. Tracce di RNA del bionalizzatore Agilent preparate da diversi tessuti di polmone di ratto FFPE mediante il sistema Agencourt FormaPure. Tutti i campioni sono stati trattati con DNAsi I.

Riepilogo

di rendimento e di purezza superiore nell'ambito di un processo compatibile con l'automazione. Questa tecnologia consente di purificare acidi nucleici a partire da un'ampia gamma di tipi di tessuti per impieghi in tecniche quali la genotipizzazione tramite polimorfismi a singolo nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism, SNP), l'espressione genica e il sequenziamento. Grazie all'utilizzo di biglie paramagnetiche, questo metodo non richiede centrifugazione, filtrazione a vuoto o solventi chimici. Il sistema Agencourt FormaPure, insieme alla workstation Beckman Coulter Biomek NXP o FXP Span-8, aiuta i ricercatori a trovare le risposte agli odierni interrogativi biologici più complessi.