Dr. Andreas Böhmler, Director Strategic Marketing Clinical Solutions, Beckman Coulter Life Sciences, Krefeld, Germany

Principali esigenze insoddisfatte

Conformità con norme e linee guida internazionali

Con il ricorso sempre più frequente alle cellule progenitrici e staminali ematopoietiche mobilizzate (HSPC) a scopo di trapianto, Sutherland et al., di concerto con la Società internazionale per l'ematoterapia e l'ingegneria tissutale (ISHAGE), hanno codificato nel 1996 una serie di norme per la conta delle cellule CD34+ con l’obiettivo di fornire un metodo semplice e accurato in grado di assicurare un elevato grado di precisione e riproducibilità tra diversi laboratori. Questo ha dato vita alle “Linee guida ISHAGE” che sono ben presto diventate lo standard di riferimento per la conta delle cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ in citofluorimetria¹. Nel 1998, Keeney et al. hanno pubblicato una versione modificata delle linee guida del 1996, introducendo le biglie per la conta assoluta, aggiungendo 7-AAD come colorante per determinare la vitalità delle cellule ed escludere le cellule morte, e un reagente di lisi che non contiene alcun fissativo². Queste modifiche hanno trasformato il protocollo di base in un metodo a piattaforma singola e le Linee guida ISHAGE per singola piattaforma con colorazione della vitalità sono rimaste per lo più intatte dopo oltre 20 anni.

La caratteristica principale delle Linee guida ISHAGE consiste in una strategia di gating sequenziale che ricava il numero delle cellule CD34+ dai leucociti vitali. Le Linee guida richiedono inoltre che i test vengano eseguiti in duplicato con un controllo negativo per correggere effetti derivanti dalla variabilità dei test e dal legame aspecifico cellula- fluorocromo. Negli anni successivi, l'elevata selettività del gating sequenziale ha portato gli autori delle Linee guida ISHAGE a rendere facoltativa l’applicazione del controllo negativo, ma in seguito la Farmacopea europea (Ph. Eur.) lo ha reso obbligatorio³. Diversamente dalle Linee guida ISHAGE, le norme descritte nella Ph. Eur. sono giuridicamente vincolanti, come previsto dalla Convenzione del Consiglio d’Europa sull’elaborazione di una farmacopea europea, e dalla legislazione farmaceutica nazionale e dell’UE.

I software IVD attualmente disponibili per l’elaborazione di test per la conta delle cellule CD34+ con o senza controllo negativo non sono abbastanza flessibili, pur mantenendo lo stato di IVD. Inoltre, non tutti i kit di reagenti per la conta di cellule CD34+ contengono un reagente di controllo negativo.

Il primo passaggio della strategia di gating sequenziale ISHAGE, ovvero la determinazione dei leucociti vitali, facilita enormemente la corretta quantificazione delle popolazioni di cellule CD34+ rare, ma considera automaticamente tutte le cellule CD34+ contate come vitali, rendendo difficile la determinazione diretta delle percentuali di cellule CD34+ vitali tra tutte le cellule CD34+. Inoltre, potrebbe essere difficile recuperare il numero totale di leucociti CD45+ dalla strategia di gating applicata per valutare la vitalità complessiva del campione⁷.

Per le cellule CD34+ derivate da sangue cordonale, la settima edizione recentemente pubblicata di ‘NetCord - FACT Norme internazionali per la raccolta e la conservazione di sangue cordonale e per la distribuzione ai fini della somministrazione’ prevede la determinazione sia del numero totale di cellule CD34+, sia del numero totale di cellule CD34+ vitali per la post-elaborazione di campioni di sangue cordonale prima della crioconservazione, nonché la valutazione della percentuale di vitalità delle cellule CD34+ prima di autorizzare la distribuzione di un’unità di sangue cordonale nell'ambito del programma clinico⁴.

Conta delle cellule CD34+ ai fini del controllo qualità (CQ)

Se la quantificazione delle cellule CD34+ viene realizzata a fini del controllo qualità, i laboratori faranno in modo di non effettuare la batteria di test completa prevista dalle Linee guida ISHAGE e costituita da test in duplicato e controllo negativo, ma realizzeranno un solo test, in particolare quando sono disponibili per le analisi solo volumi di campioni molto ridotti. L’attuale software di acquisizione non è abbastanza flessibile per adattare opportunamente la batteria di test nell'ambito della soluzione IVD. Anche se l'utilizzo di un sistema IVD non è obbligatorio ai fini del controllo qualità, la maggior parte dei laboratori che effettuano questi test sono altamente regolamentati, quindi in genere evitano di convalidare un test diverso definito dall’utente solo a questo scopo.

Tracciabilità di reagenti e campioni

I laboratori che eseguono la conta delle cellule progenitrici ematopoietiche (HCP) CD34+ sono altamente regolamentati in relazione alla tracciabilità dei dati e alla necessità di adottare un sistema molto strutturato per il controllo qualità, in particolare se devono ricevere una certificazione⁶. Di seguito sono riportati alcuni degli aspetti principali di questi meccanismi di controllo:

• Evitare errori di identificazione dei campioni durante tutta la procedura attraverso un'adeguata identificazione di tutti i campioni
• Disposizioni adeguate al fine di monitorare l’affidabilità, l’accuratezza, la precisione e le prestazioni della strumentazione e delle procedure di test
• Verifica della funzionalità di strumentazione e reagenti
• Uso di materiali di riferimento adeguati e documentazione dei test di competenza in corso
• Definizione delle procedure necessarie per evitare l’uso di forniture e reagenti scaduti
• Adozione di un meccanismo che consenta di associare il numero del lotto, la data di scadenza e il produttore di forniture e reagenti a ciascun campione.

Gli ultimi due punti possono risultare particolarmente complessi, perché i documenti relativi a reagenti e campioni spesso non sono interconnessi e risultano “offline”, ovvero fuori dalla piattaforma utilizzata per analisi e acquisizione di dati.

Automazione di laboratorio

Nei laboratori di ematoncologia, i campioni di HPC arrivano spesso come campioni urgenti (STAT) e richiedono un’attenzione immediata, con l’interruzione delle procedure di routine. Qualsiasi eventuale problema emerso in relazione a questi campioni richiede di raddoppiare gli sforzi, aumentando il rischio potenziale di errore umano. Per questi laboratori sarebbe preferibile integrare i campioni di HPC nelle normali procedure, in modo da ridurre al minimo il rischio di errori nel prelievo di campioni o di altri problemi, perché il fattore tempo è essenziale ai fini dell’analisi delle cellule HPC CD34+. Per i laboratori specializzati nella conta di cellule CD34+, come le strutture per la raccolta di sangue cordonale, un livello di automazione più elevato contribuirebbe a migliorare la gestione di elevate quantità di campioni da analizzare, assicurando anche un elevato livello di tracciabilità, come precedentemente sottolineato.

Le attuali soluzioni IVD per la conta di cellule CD34+ mediante citofluorimetria sono prive di capacità di automazione principalmente a causa dell’uso di reagenti di lisi degli eritrociti che influiscono negativamente sulla vitalità cellulare, rendendo indispensabile la conservazione dei campioni preparati in ghiaccio prima dell'analisi. Le Linee guida ISHAGE raccomandavano l’uso di cloruro di ammonio, poiché nel momento in cui sono state redatte questo era l’unico reagente di lisi disponibile indicato per un approccio “senza lavaggio”, senza la necessità di utilizzare altri fissativi e senza alterare le proprietà di scattering della popolazione di cellule interessata. Sebbene l’uso di cloruro di ammonio sia ormai consolidato praticamente in tutti i kit commerciali per la conta di cellule CD34+ in citofluorimetria, questo non permette di effettuare test su cellule CD34+ con preparazione dei campioni e piattaforme di citofluorimetria automatizzate a causa degli effetti negativi sulla vitalità cellulare e della necessità di preparare quotidianamente la diluizione di lavoro.

Attualmente sono disponibili reagenti di lisi degli eritrociti pronti per l’uso che permettono di effettuare la lisi degli eritrociti senza un impatto significativo sulla vitalità dei leucociti durante la preparazione dei campioni, consentendo di eseguire la conta di cellule CD34+ con sistemi di citofluorimetria automatizzati.

Evoluzione dello standard di riferimento

Un kit di quantificazione delle cellule CD34+ di nuova generazione per citofluorimetria permette di sfruttare tutti i vantaggi di norme e protocolli prestabiliti offrendo la flessibilità necessaria per adeguare reagenti e strumenti informatici alle attuali esigenze di un laboratorio clinico. A questo scopo, mette a disposizione batterie di test di acquisizione e analisi per le diverse esigenze di laboratorio senza la necessità di configurare test definiti dall’utente in parallelo con le soluzioni IVD, meccanismi di controllo qualità in linea con i requisiti di un ambiente di lavoro altamente regolamentato, nonché un elevato grado di automazione (Figura 1).

Figura 1. Caratteristiche di una soluzione per l’identificazione e la quantificazione di cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ in grado di soddisfare i requisiti dei laboratori clinici attuali (sulla base di ricerche di mercato quantitative).

Sistema AQUIOS STEM

Il sistema AQUIOS STEM è stato progettato con la collaborazione di esperti leader nel settore della conta di cellule CD34+ in ambito clinico per migliorare ulteriormente lo standard di riferimento. Si tratta di un approccio modulare per l’analisi automatizzata delle cellule progenitrici e staminali ematopoietiche CD34+ con citofluorimetro AQUIOS CL (Tabella 1) e prevede i seguenti elementi:

• Software AQUIOS STEM per sistema di citofluorimetria AQUIOS CL,
• Kit AQUIOS STEM di reagenti per l’enumerazione di cellule CD34+
• AQUIOS STEM CD34 Control Cells (2 livelli).

Versatilità dei test

Il software AQUIOS STEM offre tre diverse batterie di test di acquisizione per la conta clinica di cellule CD34+ (Figura 2). Tutti i protocolli seguono la strategia di gating sequenziale prevista dalle Linee guida ISHAGE, ed è prevista la possibilità di effettuare tutti e tre i test (test in duplicato e controllo negativo), come raccomandato dalle Linee guida ISHAGE e in linea con le disposizioni della Ph. Eur., ma è possibile anche utilizzare l'opzione di test ISHAGE senza controllo negativo, oppure effettuare un test singolo utilizzabile ai fini del controllo qualità per campioni rari. La soluzione IVD offre tutte le opzioni di test, senza la necessità di creare test definiti dall’utente.

Figura 2. Modalità di test del sistema AQUIOS STEM per la quantificazione di cellule HCP CD34+ in ambito clinico.

Soluzioni di reagenti e anticorpi

I reagenti del kit AQUIOS STEM sono costituiti da un reagente ad anticorpi monoclonali murini CD45-FITC/CD34-PE, un controllo negativo corrispondente (CD45-FITC/CD34-CTRL), un reagente per la conta assoluta (AQUIOS STEM-Count Fluorospheres), un reagente di vitalità cellulare (7-AAD) e un reagente di lisi pronto per l’uso. Il kit contiene una quantità di reagente sufficiente ad analizzare 50 campioni in duplicato con controllo negativo. I reagenti per CD34 e CD45 contengono i cloni raccomandati dalle Linee guida ISHAGE.

Fare riferimento alla Tabella 2 per l’elenco di tutti i componenti del sistema AQUIOS STEM e alla Tabella 3 per una panoramica dei parametri e dei tipi di campioni che possono essere analizzati con il sistema AQUIOS STEM.

Concetto di automazione

Il sistema di citofluorimetria AQUIOS CL ottimizza le operazioni integrando il caricamento automatizzato, la preparazione dei campioni, la gestione dei reagenti e la scansione del codice a barre, oltre all’analisi dei dati e alla connettività del sistema informatico del laboratorio (LIS) bidirezionale in un’unica piattaforma compatta, in un'unica soluzione di citofluorimetria Load & Go.

Il software AQUIOS STEM consente di aggiungere la conta di cellule CD34+ alle applicazioni AQUIOS CL già presenti, permettendo di automatizzare la maggior parte delle operazioni. È possibile ottenere questo risultato utilizzando un reagente di lisi degli eritrociti che sia conforme alle Linee guida ISHAGE (senza lavaggio, senza aggiunta di fissativi, senza alterazioni delle proprietà di scattering della popolazione target), che possa essere conservato e gestito a temperatura ambiente, che sia pronto per l’uso senza la necessità di preparare quotidianamente la diluizione di lavoro a partire dalle soluzioni madre, e che non sia aggressivo rispetto alle popolazioni interessate.

La soluzione delle biglie utilizzata per la conta assoluta presenta una galleggiabilità attentamente bilanciata che non richiede la miscelazione prima di ogni pipettaggio. Inoltre, il flacone contenente le biglie è dotato di un apposito tappo che previene l’evaporazione.

Il caricamento dei campioni viene effettuato utilizzando il caricatore automatico per campioni multipli di AQUIOS CL, oppure il caricatore a provetta singola per campioni STAT, che vengono prioritizzati rispetto ad altri campioni in attesa. Questo permette di assicurare la continuità della procedura senza interrompere le operazioni. La preparazione dei campioni viene effettuata in piastre Deep-Well da 96 pozzetti con sonde singole per la preparazione e l’analisi del campione, in modo da realizzare entrambe le fasi in parallelo e analizzare i campioni subito dopo la preparazione.

Figura 3. Il caricatore automatico si adatta a provette di varie dimensioni e può caricare fino a 40 campioni alla volta, con funzione di carico e scarico continuo in ordine casuale. Il sistema utilizza uno scanner di codici a barre interno per il tracciamento di campioni positivi tra i campioni del caricatore automatico. L’ID del campione viene associato alla richiesta e le informazioni del paziente risultano immediatamente accessibili durante l'elaborazione dei campioni. È disponibile un caricatore separato a provetta singola per campioni STAT, campioni con provette aperte o provette di dimensioni non regolari.

AQUIOS CL può essere utilizzato senza problemi anche da operatori non esperti di citofluorimetria, permettendo al personale di dedicarsi ad altre attività in modo da massimizzare la produttività.

Meccanismi di controllo qualità

Reagenti con codice a barre. I reagenti AQUIOS sono dotati di un identificativo univoco tramite  codice a barre per effettuare il tracciamento della data di scadenza, della scadenza dopo l’apertura del contenitore, del lotto e dei codici del contenitore. Il consumo del reagente e l’usura della piastra vengono monitorati dal sistema durante l'elaborazione dei campioni. Il lettore del codice a barre scansiona il reagente o la piastra al primo utilizzo, garantendo che le informazioni sui materiali siano prive di errori. Il sistema di tracciamento del reagente Smart Track AQUIOS permette di effettuare in tempo reale il tracciamento dei materiali per garantire che vengano utilizzati reagenti con la datazione corretta e che sia disponibile una quantità sufficiente di reagente per ciascun campione: in questo modo viene eliminato il rischio di dover processare nuovamente i campioni a causa di livelli insufficienti di reagente. Il sistema non avvia l'esecuzione di un test, se non dopo aver verificato che siano presenti le fiale di anticorpi necessarie.

Codici a barre dei campioni e ID dei campioni positivi. Il lettore dei codici a barre delle provette AQUIOS CL è in grado di leggere automaticamente i codici a barre dei campioni senza utilizzare uno scanner portatile. Il citofluorimetro AQUIOS CL associa il codice a barre della provetta con la richiesta LIS. L’ID del campione viene immediatamente registrato prima dell'aspirazione per evitare errori di identificazione, e viene tracciato automaticamente nel corso della procedura.

Controlli di processo. Le cellule di controllo AQUIOS STEM CD34 sono preparazioni liquide di leucociti umani stabilizzati per la verifica dei parametri CD34 e CD45 che fanno parte del sistema AQUIOS STEM. Ciascun kit contiene due livelli di CD34 con circa 10 cellule CD34+ per µL (Livello 1) e circa 30 cellule CD34+ per µL (Livello 2). I valori dei test vengono inseriti nel sistema effettuando la scansione del codice a barre della scheda del test delle cellule di controllo.

Il modulo per il controllo qualità del software AQUIOS STEM permette di accedere a eIQAP, il programma di controllo qualità elettronico interlaboratorio di Beckman Coulter, che consente agli utenti di ottenere report di confronto tra gruppi comparabili di dati di controllo qualità dei  laboratori.

Blocco automatico se il controllo qualità non viene superato. Il citofluorimetro AQUIOS CL è stato progettato come strumento Load & Go ed è dotato di una funzionalità di blocco automatica che l’utente può abilitare per procedere automaticamente all'elaborazione dei campioni dei pazienti, una volta effettuato il controllo qualità. Se questa funzionalità è abilitata e il controllo qualità non viene superato, lo strumento non elabora i campioni dei pazienti e l’utente riceve subito un avviso.

Controlli di sistema. Il sistema verifica automaticamente la potenza del laser e che il vuoto sia a livelli accettabili prima di effettuare l'elaborazione di un campione. Il sistema verifica anche le connessioni interne e che l’hardware funzioni correttamente nel corso della procedura. Inoltre, il sistema esegue un controllo dei fluidi prima dell'elaborazione, per assicurare che sia disponibile una quantità sufficiente di AQUIOS Sheath Solution per la procedura.

Modalità di reporting avanzate

Per contribuire ad assicurare il rispetto di norme e requisiti interni ed esterni relativi al controllo qualità, il software AQUIOS STEM mette a disposizione numerosi parametri statistici aggiuntivi rispetto ai report di citofluorimetria tradizionalmente utilizzati per la quantificazione di cellule CD34+ (Tabella 1). Fare riferimento alla scheda applicativa “Criteri di conformità del sistema AQUIOS STEM alle linee guida internazionali per la conta delle cellule progenitrici e staminali ematopoietiche CD34+ in clinica” per un elenco completo delle caratteristiche.

Tabella 1. Riepilogo delle statistiche e dei parametri di popolazione aggiuntivi raccolti dal sistema AQUIOS STEM rispetto ai report di citofluorimetria tradizionalmente utilizzati per la quantificazione di cellule CD34+ che contribuiscono al rispetto di norme e requisiti interni ed esterni relativi al controllo qualità.

Parametri di sistema e componenti del sistema AQUIOS STEM

Il sistema AQUIOS STEM adotta un approccio modulare per effettuare l’analisi automatizzata delle cellule progenitrici e staminali ematopoietiche CD34+ con citofluorimetro AQUIOS CL. La soluzione prevede l'uso dei componenti indicati nella Tabella 2 ed è pensata per un utilizzo da parte di operatori di laboratorio nella rilevazione dei parametri nei tipi di campioni indicati nella Tabella 3 con il sistema di citofluorimetria AQUIOS CL automatizzato.

Table 2. Riepilogo delle statistiche e dei parametri di popolazione aggiuntivi raccolti dal sistema AQUIOS STEM rispetto ai report di citofluorimetria tradizionalmente utilizzati per la quantificazione di cellule CD34+ che contribuiscono al rispetto di norme e requisiti interni ed esterni relativi al controllo qualità.

Tabella 3. Parametri del sistema AQUIOS STEM

Bibliografia

1. Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, Nayar R, Chin-Yee I: The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J Hematother. 1996 Jun;5(3):213-26.
2. Keeney M, Chin-Yee I, Weir K, Popma J, Nayar R, Sutherland DR: Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. Cytometry. 1998 Apr 15;34(2):61-70.
3. EDQM Council of Europe: European Pharmacopoeia (Ph. Eur.). 10th Edition 2019-2022. Website: https://pheur.edqm.eu/home
4. Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT): NetCord-FACT international standards for cord blood collection, banking, and release for administration. 7^th Edition, 2019. Website: http://www.factwebsite.org/
5. Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT) - Joint Accreditation Committee (JACIE): FACT-JACIE International standards for hematopoietic cellular therapy product collection, processing, and administration. 8^th Edition, 2021. Website: http://www.factwebsite.org/
6. Dorn-Beineke A, Sack U: Quality control and validation in flow cytometry. J Lab Med 2016; 40 s1:1-13.
7. Whitby A, Whitby L, Fletcher M, Reilly JT, Sutherland DR, Keeney M, Barnett D: ISHAGE protocol: are we doing it correctly? Cytometry B Clin Cytom. 2012 Jan;82B:9-17.