Materiali

• PBS
• Siero bovino fetale
• Reagente 1, 2 e 3 PerFix-nc (Numero della parte B10825)
• PBS con 0,5% formaldeide

Linee cellulari

1. Utilizzare le linee cellulari a 5 x 10⁶ cellule per ml, 100 μl per test (5 x 10⁵ cellule per test)
2. Aggiungere 2,5 uL*di colorante ViaKrome Viability
3. Vortex
4. Incubare a 18–25 °C per 20 minuti, al riparo dalla luce
5. Aggiungere 3 ml di PBS 1X
6. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g
7. Aspirare il surnatante
8. Aggiungere 500 µl di PBS 1X/formaldeide 0,5%
9. Acquisire i dati utilizzando un citometro a flusso

*Per l’uso con altri protocolli e/o campioni, si raccomanda una titolazione del colorante ViaKrome Fixable Viability per stabilire la dose ottimale.

Colorazione rappresentativa utilizzando coloranti ViaKrome Fixable Viability. Rappresentazione bi-parametrica (scatter laterale rispetto a intensità della fluorescenza) della colorazione di una miscela di cellule non trattate (cellule vive) e cellule Jurkat trattate termicamente (cellule morte). L’acquisizione è effettuata con un citometro a flusso CytoFLEX LX N-V-B-Y-R-I Series e l’emissione è stata rilevata tramite il filtro passo banda indicato. Il colorante ViaKrome 405 è stato eccitato con il laser violaceo (405 nm), pannello A, il colorante ViaKrome 561 eccitato con il laser giallo verde (561 nm), pannello B, il colorante ViaKrome 638 è stato eccitato con il laser rosso (638 nm), pannello C, e ViaKrome 808 è stato eccitato con il laser a infrarossi (808 nm), pannello D.

Cellule mononucleate del sangue periferico (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)

1. Aggiungere 2,5 μl del colorante ViaKrome Fixable Viability in 50 μl PBMC a 10 x 10⁶ cellule/ml
2. Vortex
3. Incubare a 18–25 °C per 20 minuti, al riparo dalla luce
4. Aggiungere 3 ml di PBS 1X
5. Centrifugare a 150 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante mediante aspirazione
6. Aggiungere 50 μl di siero bovino fetale. Agitare fino a quando il pellet è dissociato.
7. Procedere con la colorazione intracellulare

*Per l’uso con altri protocolli e/o campioni, si raccomanda una titolazione del colorante ViaKrome Fixable Viability per stabilire la dose ottimale.

Colorazione rappresentativa utilizzando coloranti ViaKrome Fixable Viability. Rappresentazione bi-parametrica (scatter laterale rispetto a intensità della fluorescenza) della colorazione di cellule mononucleate del sangue periferico (PMBC). L’acquisizione è effettuata con un citometro a flusso CytoFLEX LX N-V-B-Y-R-I Series e l’emissione è stata rilevata tramite il filtro passo banda indicato. Il colorante ViaKrome 405 è stato eccitato con il laser violaceo (405 nm), pannello A, il colorante ViaKrome 561 eccitato con il laser giallo verde (561 nm), pannello B, il colorante ViaKrome 638 è stato eccitato con il laser rosso (638 nm), pannello C, e ViaKrome 808 è stato eccitato con il laser a infrarossi (808 nm), pannello D.