Assistenza sul sistema EMnetik 24

Limiti del cleanup della PCR con EMnetik

  • Il kit di cleanup della PCR EMnetik supporta volumi di ingresso e di eluizione del campione da 20 µl a 50 µl. Eventuali procedure al di fuori di questo intervallo potrebbero dare luogo a rese inferiori. Si consiglia un volume di eluizione di 50 µl, anche se il processore di microparticelle EMnetik 24 è in grado di supportare volumi fino a 20 µl; tenere presente, inoltre, che volumi di eluizione inferiori potrebbero ridurre sia la resa che la purezza.
  • Limiti di concentrazione: 800 ng/µl e con dimensioni del frammento fino a 10 kilobasi
  • Limiti di dimensione: Attualmente non supporta il DNA genomico 
     
     

Domande frequenti sul sistema di cleanup della PCR EMnetik

D: Bind vortexing - Quante volte devo pipettare la miscela prima di aggiungere le biglie?
R: Il flacone deve essere agitato per 30 secondi, ma è possibile miscelare con una pipetta il buffer di biglie aliquotato in un contenitore per reagenti per almeno 10 volte o fino alla completa miscelazione.

D: È possibile utilizzare provette/tipi di piastra diversi da quelli consigliati?
R: Il cleanup della PCR EMnetik è stato ottimizzato con le provette/tipi di piastra consigliati. Nel caso in cui vengano utilizzati materiali diversi potrebbe essere necessaria un’ulteriore ottimizzazione. È importante che le provette/piastre entrino completamente in contatto con la parte inferiore del portaprovette, per una miscelazione e un recupero del DNA ottimale

D: È possibile utilizzare altre biglie magnetiche?
R: No. Utilizzando biglie non supportate, queste non verrebbero miscelate correttamente determinando una riduzione significativa in termini di resa.

D: Il reagente delle biglie per il cleanup della PCR EMnetik permette di effettuare la selezione delle dimensioni, come nel caso di AMPureXP e SPRISelect?
R: L'uso di queste biglie non è consigliato per la selezione delle dimensioni degli acidi nucleici.

D: È possibile ridurre la quantità di reagente utilizzata per il cleanup della PCR EMnetik per volume di campione?
R: No, il reagente per il cleanup della PCR EMnetik deve avere un rapporto pari a 1,8× rispetto al volume del campione per una miscelazione ottimale.

D: È possibile eseguire la fase "Bind mix & separate" più di una volta?
R: Se si desidera ottimizzare il tempo di legame, è possibile eseguire nuovamente la fase "Bind mix & separate" selezionando e facendo clic su "Miscelazione legame e separazione" nell'interfaccia utente. Si tratta di un'operazione utile soprattutto in presenza di concentrazioni di DNA particolarmente elevate o ridotte. NOTA Quando si esegue la fase "Bind mix & separate" più volte, alternarla all'operazione di inizializzazione e aggiunta del reagente per effettuare il ripristino dei magneti.

D: È possibile effettuare un’eluizione nel buffer TE?
R: Sì, il buffer TE è un buffer di eluizione compatibile. In alcuni casi abbiamo osservato che con l’eluizione in acqua si ottiene una resa leggermente superiore.

D: È possibile effettuare un’eluizione più lunga rispetto al tempo indicato?
R: Se si desidera ottimizzare il tempo di eluizione, è possibile eseguire nuovamente la fase di eluizione premendo l'icona "Elution mix & separate" nell'interfaccia utente. Si tratta di un’operazione utile soprattutto in presenza di biglie particolarmente asciutte. NOTA Quando si esegue la fase "Elution mix & separate" più volte, alternarla all'operazione di inizializzazione e aggiunta del reagente per effettuare il ripristino dei magneti.

 

Risoluzione dei problemi relativi al cleanup della PCR con EMnetik

Resa inferiore alle aspettative:

Possibili cause Possibili soluzioni e informazioni
Miscelazione insufficiente del reagente per il cleanup della PCR EMnetik
Assicurarsi che il flacone del reagente in biglie venga miscelato per almeno 30 secondi appena prima dell’uso, anche se sembra essere già stato miscelato. Quando si utilizzano contenitori per reagenti, trasferire il reagente contenente le biglie miscelato nel serbatoio e usarlo immediatamente.
Perdita di biglie Perdita di biglie durante l’aspirazione: Evitare di toccare le biglie con la punta della pipetta durante le aspirazioni. Laddove dovesse capitare di aspirare delle biglie, dispensarle nuovamente nella provetta o nel pozzetto e lasciare che si depositino in direzione del magnete prima di aspirare di nuovo. Perdita di biglie a causa di un’eliminazione insufficiente: Attendere che venga visualizzato il comando Done (Fine) per questa fase del protocollo, verificando che le biglie abbiano effettivamente formato un pellet sul lato della provetta o del pozzetto prima di aspirare e rimuovere il surnatante.
Ridotta concentrazione di etanolo

L'etanolo è igroscopico e, nel tempo, può diluirsi ulteriormente. Per risultati ottimali, preparare ongi giorno nuovo etanolo al 75%.

Contaminazione da DNasi Verificare che la DNasi non sia fonte di contaminazione durante la fase di isolamento. Evitare che i puntali delle pipette entrino in contatto con superfici non sterili.
Biglie troppo asciutte Verificare che le biglie non siano essiccate per un tempo superiore a quello indicato nel protocollo.
Eluizione incompleta Verificare che il buffer di eluizione sia in grado di raggiungere le biglie e che non vi siano goccioline sulle pareti del pozzetto o della provetta.
Utilizzo di provette/tipi di piastra diversi da quelli consigliati
Se vengono utilizzate provette o piastre diverse da quelle consigliate, queste potrebbero posizionarsi in maniera non corretta nello strumento non permettendo di ottenere una miscelazione efficace. Utilizzare solo piastre e provette consigliate.

Scarsa purezza:

Possibili cause Possibili soluzioni e informazioni
Elevata concentrazione di etanolo
La concentrazione di etanolo utulizzata nei lavaggi può essere ridotta al 70% per aumentare la purezza. Ciò determina però una riduzione in termini di resa.

Contaminazione da etanolo:

Possibili cause Possibili soluzioni e informazioni
Rimozione incompleta dell’etanolo
Utilizzare puntali per il caricamento dei gel o puntali da 20 µl per effettuare la rimozione dell’etanolo. Rimuovere eventuali gocce dal lato della provetta. Per spostare le goccioline dal fondo e facilitarne l'eliminazione, rimuovere la piastra dal dispositivo picchiettandola leggermente, se necessario. Pipettare dal fondo del pozzetto. Accertarsi di rimuovere completamente l’etanolo visibile prima di passare alla fase di essiccazione dell'etanolo e aggiunta dell'eluente. Verificare che il tempo di essiccazione dell’etanolo sia sufficiente e che non vi siano gocce visibili nella provetta prima dell’eluizione.
L’etanolo viene trattenuto nel pellet di bigliet
Rimuoverlo dal dispositivo e consentire alle biglie di depositarsi (30 secondi) e di ritornare verso il magnete, quindi rimuovere l’etanolo in eccesso. I campioni possono essere anche centrifugati brevemente per rimuovere le biglie dal lato della provetta prima che queste ritornino verso il magnete. Inoltre, alcune biglie potrebbero non ritornare verso il magnete. Tuttavia, rimuovendo accuratamente l'etanolo senza le biglie, sarà possibile recuperarle nel momento in cui si aggiunge acqua per l'eluizione. Tempo di essiccazione maggiore: questa fase può essere eseguita anche insieme alla procedura indicata sopra.
Impossibile determinare la presenza di residui di etanolo

Rimuovere dal dispositivo ed controllare; riposizionare la piastra nel dispositivo e attendere la formazione del pellet di biglie (10 secondi) prima di rimuovere l’etanolo in eccesso.

Domande frequenti sulla purificazione di plasmidi con EMnetik

D: È possibile usare volumi di campione diversi?
R: Questo protocollo è stato ottimizzato per un volume di reazione compatibile con EMnetik 24. L'aggiunta di una quantità maggiore o minore di campione determinerà una variazione delle proporzioni di concentrazione tra campione, isopropanolo e biglie e una riduzione della resa a causa della miscelazione incompleta.

D: È possibile portare il volume di eluizione sotto i 50 µl?
R: Si consiglia un volume di eluizione di 50 µl, anche se il processore di microparticelle EMnetik 24 è in grado di supportare volumi fino a 20 µl; tenere presente, inoltre, che volumi di eluizione inferiori potrebbero ridurre sia la resa che la purezza.

D: È possibile aggiungere le biglie e l’isopropanolo contemporaneamente e in anticipo?
R: Le biglie e l’isopropanolo possono essere combinati fino a 30 minuti prima del trasferimento nel mixer; tuttavia, l’efficienza e la resa possono diminuire dopo 15 minuti.

D: È necessario miscelare le biglie in ogni fase?
R: Sì, è necessario miscelarle ogni volta. Le biglie tendono a depositarsi rapidamente; la mancata miscelazione determinerà la presenza di una quantità di biglie errata nella reazione. Test di laboratorio hanno dimostrato un calo delle prestazioni in caso di miscelazione incompleta.

D: È necessario vortexare per 30 secondi?
R: Sì, nei casi in cui è indicata una miscelazione al vortex per 30 secondi, si tratta di una procedura necessaria per garantire prestazioni ottimali. Vortexare una provetta PLP per 10 secondi invece di 30 determinerà una riduzione in termini di resa e potrebbe alterare le proporzioni delle biglie in vista di un uso successivo.

D: È possibile utilizzare altre biglie?
R: No. Utilizzando biglie non supportate, queste non verrebbero miscelate correttamente determinando una riduzione significativa in termini di resa.

D: È possibile ridurre la quantità di biglie per volume di campione?
R: No, il buffer di biglie deve avere una proporzione adeguata tra isopropanolo e biglie per ottenere una miscelazione ottimale

D: È possibile eseguire la fase "Bind mix & separate" più di una volta?
R: Se si desidera ottimizzare il tempo di legame, è possibile eseguire nuovamente la fase "Bind mix" premendo l'icona "Bind mix & separate" nell'interfaccia utente. Si tratta di un'operazione utile soprattutto in presenza di concentrazioni di DNA particolarmente elevate o ridotte, o in presenza di plasmidi di grandi dimensioni. Nota: quando si esegue la fase "Bind mix & separate" più volte, alternarla all'operazione di inizializzazione e aggiunta del reagente per effettuare il ripristino dei magneti.

D: Ho trasferito parte del flocculante. Cosa posso fare?
R: Il trasferimento di flocculante nella fase "Bind" potrebbe ridurre la qualità o causare una contaminazione del DNA genomico. Se si ritiene che il flocculante non sia stato adeguatamente ridotto in pellet, centrifugare il lisato un po’ più a lungo.

D: È possibile utilizzare pellet congelati per la purificazione?
R: I pellet si congelano a una temperatura di -20°C e dopo essere stati risospesi, sarà necessario vortexare per disgregare i pellet congelati o lasciarli riposare per diversi minuti nel buffer di risospensione per farli ammorbidire.

D: È possibile ottimizzare le prestazioni per le singole provette, al contrario delle piastre, per la preparazione del lisato?
R: Sì, è possibile apportare diverse modifiche per ridurre le tempistiche e ottimizzare le prestazioni quando non si utilizzano piastre complete: Neutralizzazione: Invertire 5-10 volte, quindi procedere alla centrifugazione invece di miscelare con l’agitatore per 10 minuti. Centrifugazione: Dimezzare il tempo a 10 minuti e aumentare la velocità a > 10.000 rcf.

 

Risoluzione dei problemi relativi alla purificazione di plasmidi con EMnetik

Resa inferiore alle aspettative:

Possibili cause Possibili soluzioni e informazioni
Biglie non correttamente miscelate
Omogeneizzare completamente le biglie in tutte le fasi di miscelazione.
Concentrazione errata di isopropanolo e biglie
Assicurarsi che le biglie siano state miscelate completamente prima di trasferirle nei pozzetti. Verificare attentamente che il volume delle biglie e dell’isopropanolo siano stati calcolati correttamente e che nessuna goccia di liquido contenente biglie si trovi al di fuori della punta della pipetta.
Quantità di cellule insufficiente

Se i pellet sono troppo piccoli o la densità cellulare misurata è ridotta, rivedere i parametri di coltura per ottenere colture migliori. Accertarsi di ridurre in pellet le cellule quando si trovano ancora nella fase di crescita logaritmica. Non aggiungere antibiotici in quantità eccessiva o troppo scarsa. Far crescere le cellule in un terreno colturale idoneo. Accertarsi che le colture vengano agitate adeguatamente durante l’incubazione e che ricevano una quantità di ossigeno sufficiente. Ottimizzare la quantità di inoculo. Accertarsi che la pre-coltura sia sana e non eccessivamente sviluppata. Accertarsi che tutte le cellule vengano ridotte in pellet durante la centrifugazione e che i pellet non si stacchino durante la fase di decantazione. Le cellule ridotte in pellet si trovano in fase di morte. Le cellule in fase di morte possono perdere i propri plasmidi, riducendo la resa. Utilizzare una curva di crescita per individuare il momento in cui le cellule entrano in fase di morte e pellettarle durante la curva di crescita.

Biglie troppo asciutte
I plasmidi di grandi dimensioni potrebbero legarsi alle biglie. Evitare di far essiccare completamente le biglie durante l'estrazione dei plasmidi.
Miscelazione inadeguata
Accertarsi che le biglie vengano miscelate correttamente in tutte le fasi di trasferimento.
Perdita di biglie
Rimuovere il surnatante solo dopo che le biglie si sono depositate ed evitare di aspirarle durante la rimozione del surnatante e dell’etanolo.
Materiale di laboratorio non inserito in EMnetik 24
Verificare che il materiale sia stato correttamente inserito nel miscelatore prima di procedere. Se si utilizzano provette singole, verificare che l’accessorio di supporto della provetta sia stato inserito per mantenerla in posizione. In presenza di materiale di laboratorio inserito erroneamente potrebbe verificarsi una miscelazione inadeguata durante la fase "Bind" o l’eluizione.
Concentrazione di etanol
Accertarsi di utilizzare etanolo al 70% appena preparato. L'etanolo è igroscopico e, col passare tempo, può diluirsi ulteriormente. Concentrazioni inferiori di etanolo possono causare perdite in termini di resa.
Disgregazione incompleta del pellet
Vortexare o miscelare in agitatori orbitali/a piattaforma per 30 secondi se non è possibile disgregare il pellet pipettando semplicemente.

RNA nell’eluito:

Possibili cause Possibili soluzioni e informazioni
Biglie non correttamente miscelate
Omogeneizzare completamente le biglie in tutte le fasi di miscelazione.
Concentrazione errata di isopropanolo e biglie
Assicurarsi che le biglie siano state miscelate completamente prima di trasferirle nei pozzetti. Verificare attentamente che il volume delle biglie e dell’isopropanolo siano stati calcolati correttamente e che nessuna goccia di liquido contenente biglie si trovi al di fuori della punta della pipetta.
Quantità di cellule insufficiente

Se i pellet sono troppo piccoli o la densità cellulare misurata è ridotta, rivedere i parametri di coltura per ottenere colture migliori. Accertarsi di ridurre in pellet le cellule quando si trovano ancora nella fase di crescita logaritmica. Non aggiungere antibiotici in quantità eccessiva o troppo scarsa. Far crescere le cellule in un terreno colturale idoneo. Accertarsi che le colture vengano agitate adeguatamente durante l’incubazione e che ricevano una quantità di ossigeno sufficiente.Ottimizzare la quantità di inoculo. Accertarsi che la pre-coltura sia sana e non eccessivamente sviluppata. Accertarsi che tutte le cellule vengano ridotte in pellet durante la centrifugazione e che i pellet non si stacchino durante la fase di decantazione. Le cellule ridotte in pellet si trovano in fase di morte. Le cellule in fase di morte possono perdere i propri plasmidi, riducendo la resa. Utilizzare una curva di crescita per individuare il momento in cui le cellule entrano in fase di morte e pellettarle durante la curva di crescita.

Biglie troppo asciutte
I plasmidi di grandi dimensioni potrebbero legarsi alle biglie. Evitare di far essiccare completamente le biglie durante l'estrazione dei plasmidi.
Miscelazione inadeguata
Accertarsi che le biglie vengano miscelate correttamente in tutte le fasi di trasferimento.
Perdita di biglie
Rimuovere il surnatante solo dopo che le biglie si sono depositate ed evitare di aspirarle durante la rimozione del surnatante e dell’etanolo.
Materiale non correttamente posizionato in EMnetik 24
Verificare che il materiale sia stato correttamente posizionato nello strumento prima di procedere. Se si utilizzano provette singole, verificare che il dispositivo di supporto della provetta sia stato inserito per mantenerla in posizione. In presenza di materiale inserito erroneamente potrebbe verificarsi una miscelazione inadeguata durante la fase "Bind" o eluizione.
Concentrazione di etanolo
Accertarsi di utilizzare etanolo al 70% appena preparato. L'etanolo è igroscopico e, nel tempo, può diluirsi ulteriormente. Concentrazioni inferiori di etanolo possono causare una perdita in termini di resa.
Disgregazione incompleta del pellet
Vortexare o miscelare in agitatori orbitali/a piattaforma per 30 secondi se non è possibile disgregare il pellet semplicemente pipettando.

Flocculato aspirato durante il trasferimento:

Possibili cause Possibili soluzioni e informazioni
Biglie non correttamente miscelate Omogeneizzare completamente le biglie in tutte le fasi di miscelazione.
Concentrazione errata di isopropanolo e biglie Assicurarsi che le biglie siano state miscelate completamente prima di trasferirle nei pozzetti. Verificare attentamente che il volume delle biglie e dell’isopropanolo siano stati calcolati correttamente e che nessuna goccia di liquido contenente biglie si trovi al di fuori della punta della pipetta.
Quantità di cellule insufficiente Se i pellet sono troppo piccoli o la densità cellulare misurata è ridotta, rivedere i parametri di coltura per ottenere colture migliori. Accertarsi di ridurre in pellet le cellule quando si trovano ancora nella fase di crescita logaritmica. Non aggiungere antibiotici in quantità eccessiva o troppo scarsa. Far crescere le cellule in un terreno colturale idoneo. Accertarsi che le colture vengano agitate adeguatamente durante l’incubazione e che ricevano una quantità di ossigeno sufficiente. Ottimizzare la quantità di inoculo. Accertarsi che la pre-coltura sia sana e non eccessivamente sviluppata. Accertarsi che tutte le cellule vengano ridotte in pellet durante la centrifugazione e che i pellet non si stacchino durante la fase di decantazione. Le cellule ridotte in pellet si trovano in fase di morte. Le cellule in fase di morte possono perdere i propri plasmidi, riducendo la resa. Utilizzare una curva di crescita per individuare il momento in cui le cellule entrano in fase di morte e pellettarle durante la curva di crescita.
Biglie troppo asciutte I plasmidi di grandi dimensioni potrebbero legarsi alle biglie. Evitare di far essiccare completamente le biglie durante l'estrazione dei plasmidi.
Miscelazione inadeguata Accertarsi che le biglie vengano miscelate correttamente in tutte le fasi di trasferimento.
Perdita di biglie Rimuovere il surnatante solo dopo che le biglie si sono depositate ed evitare di aspirarle durante la rimozione del surnatante e dell’etanolo.
Materiale non correttamente posizionato in EMnetik 24 Verificare che il materiale sia stato correttamente posizionato nello strumento prima di procedere. Se si utilizzano provette singole, verificare che il dispositivo di supporto della provetta sia stato inserito per mantenerla in posizione. In presenza di materiale inserito erroneamente potrebbe verificarsi una miscelazione inadeguata durante la fase "Bind" o eluizione.
Concentrazione di etanolo
Accertarsi di utilizzare etanolo al 70% appena preparato. L'etanolo è igroscopico e, nel tempo, può diluirsi ulteriormente. Concentrazioni inferiori di etanolo possono causare una perdita in termini di resa.
Disgregazione incompleta del pellet
Vortexare o miscelare in agitatori orbitali/a piattaforma per 30 secondi se non è possibile disgregare il pellet pipettando semplicemente.

Contaminazione da etanolo:

Possibili cause Possibili soluzioni e informazioni
Rimozione incompleta dell’etanolo
Utilizzare puntali per il caricamento del gel o puntali da 20 µl per effettuare la rimozione dell’etanolo. Rimuovere eventuali gocce dal lato della provetta. Per spostare le goccioline dal fondo e facilitarne l'eliminazione, rimuovere la piastra dal dispositivo picchiettandola leggermente, se necessario. Pipettare dal fondo del pozzetto.
L’etanolo viene assorbito dal pellet di biglie
Rimuoverlo dal dispositivo e consentire alle biglie di depositarsi (30 secondi) e di ritornare verso il magnete, quindi rimuovere l’etanolo in eccesso. I campioni possono essere anche centrifugati brevemente per rimuovere le biglie dal lato della provetta prima che queste ritornino verso il magnete. Inoltre, alcune biglie potrebbero non ritornare verso il magnete. Tuttavia, rimuovendo accuratamente l'etanolo senza le biglie, sarà possibile recuperarle nel momento in cui si aggiunge acqua per l'eluizione. Tempo di essiccazione maggiore: questa fase può essere eseguita anche insieme alla procedura indicata sopra.
Impossibilità determinare la presenza di residui di etanolons
Rimuovere dal dispositivo ed esaminare; riposizionare la piastra nel dispositivo e attendere la formazione del pellet di biglie (10 secondi) prima di rimuovere l’etanolo in eccesso.

 

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