Introduzione

Poiché la citometria a flusso continua a sviluppare capacità crescenti (l’aggiunta di laser, più rilevatori e una migliore elaborazione del segnale), le applicazioni a parametri elevati hanno iniziato a uscire dai laboratori specializzati per entrare nella pratica comune. Gli utenti spesso sono spaventati dal processo di creazione di queste applicazioni a parametri elevati: i dati di alta qualità richiedono più iterazioni di combinazioni anticorpo-fluorocromo che costituiscono un pannello e test esaustivi per garantire buoni risultati. Le innovazioni nel rilevamento del segnale della citometria a flusso facilitano il processo di progettazione dei pannelli e di generazione dei dati.

L’implementazione di fotodiodi a valanga (APD) per il rilevamento del segnale in CytoFLEX offre due vantaggi chiave per consentire una progettazione dei pannelli più semplice. In primo luogo, gli APD sono più sensibili dei tubi fotomoltiplicatori (PMT) in una gamma più ampia dello spettro. In secondo luogo, questa maggiore fotosensibilità comporta meno errori di misurazione, il che riduce al minimo la diffusione. (1) La riduzione al minimo della diffusione di spillover in esperimenti con parametri elevati consente una migliore distinzione tra popolazioni in dissolvimento e negative, con conseguente selezione di canali meno critici per i marcatori di dissolvimento. Facendo un ulteriore passo in avanti, la facilità di progettazione può essere ottenuta utilizzando pannelli di reagenti essiccati e unificati come DURAClone. L’utilizzo dei pannelli DURAClone IM come strutture portanti permette al ricercatore di rilasciare ulteriori colorazioni secondo necessità, mantenendo al contempo molti parametri stabili e pre-ottimizzati.

La combinazione delle tecnologie innovative di CytoFLEX e DURAClone consente la creazione di esperimenti a parametri elevati con meno sforzo per la progettazione e l’impostazione. In questa nota, dimostreremo la facilità di progettazione dei pannelli e di generazione dei dati audio, utilizzando i pannelli di sottogruppi di cellule T CytoFLEX LX e DURAClone IM Inoltre, con l’elevato numero di canali di rilevamento su CytoFLEX LX, può essere modificata una singola struttura DURAClone IM per adattarsi a più design ed esigenze sperimentali, consentendo una rapida risposta alle nuove necessità di laboratorio. Questo articolo si concentra su un pannello a 18 colori progettato e testato rapidamente utilizzando queste tecnologie.

Figura 1. Confronto tra sistemi basati su PMT e sistemi basati su APD. 

Pannello A. Grafico che rappresenta l’efficienza quantica (QE), ovvero la resa di conversione fotone-elettrone, di APD e PMT nell’intervallo spettrale. Questa maggiore resa di conversione fotone-elettrone riduce l’errore di misurazione facilitando così una maggiore sensibilità e risoluzione. Grafico adattato da “A Comparison of Avalanche Photodiode and Photomultiplier Tube Detectors for Flow Cytometry” di Paul Wallace et al, 2008, Proceedings of SPI, Vol 6859. ²

Pannello B. Il confronto delle sfere di picco Spherotech 8 su PMT (sinistra) e APD (destra) mostra una migliore risoluzione delle sfere con maggiore dissolvimento a causa dell’aumento della QE, specialmente per lunghezze d’onda di emissione superiori a 650 nm.

Pannello C. Una QE superiore contribuisce anche a una minore diffusione dei dati nei rilevatori adiacenti nei sistemi basati su APD (destra) rispetto ai sistemi basati su PMT (sinistra).

Pannello D. Confronto del flusso di lavoro della progettazione dei pannelli di anticorpi con e senza DURAClone. I pannelli DURAClone semplificano la costruzione di pannelli di grandi dimensioni fornendo reagenti stabili pre-ottimizzati per la struttura portante del pannello. Utilizzare DURAClone da solo o eseguire il test e aggiungere altri colori.

Materiali e metodi

SUGGERIMENTI PER UNA PROCEDURA CORRETTA

• Quando si utilizzano più coloranti violetto brillante o ultravioletto brillante, è necessario aggiungere il tampone colorante brillante alla provetta DURAClone prima di aggiungere i coloranti per evitare interazioni con i coloranti che possono causare artefatti.
• Agitare la provetta DURAClone immediatamente dopo l’aggiunta del campione e di ulteriori coniugati anticorpali per garantire la miscelazione corretta dei reagenti.

Risultati

Figura 5. Progettazione del pannello a 17 marcatori e 18 colori. Il pannello precedente mostra le combinazioni marcatore-fluorocromo utilizzate in questo studio. La struttura portante del sottogruppo di cellule T DURAClone IM, composto da 10 colori, è evidenziato in rosso. I canali che non sono stati utilizzati sono ombreggiati in grigio.

Figura 6a. Strategia di gating ad alta purezza.

Cellule T CD4+

Figura 6b. Analisi del sottogruppo di cellule T CD4

CelluleT CD8+

Figura 6c. Analisi del sottogruppo di cellule T CD8

Cellule B

Figura 6d. Analisi del sottogruppo di cellule B

Figura 7. Matrice di compensazione e gating gerarchico

Durante questo esperimento sono stati testati in totale tre donatori sani, 24 ore dopo la venipuntura. A partire dal sottogruppo di cellule T DURAClone IM, che comprende 10 colori, come struttura portante, sono stati aggiunti otto marcatori per completare il pannello. Le combinazioni marcatore-fluorocromo aderiscono ai principi standard del design multicolore e prendono in considerazione anche la disponibilità di coniugati per i marcatori desiderati.

Prima di applicare l’analisi delle cellule T, viene applicata una strategia di gating preliminare. Utilizzando il colorante di vitalità fissabile a IR, le cellule morte sono escluse e le cellule vive sono sottoposte a gating. Le cellule vive vengono quindi tracciate su un diagramma SSC e CD45, utilizzato per identificare il leucocita (WBC); viene disegnato un gate intorno ai WBC per escludere i residui. Il gate dei linfociti viene disegnato intorno alla popolazione che presenta un profilo di fluorescenza CD45 alto e SSC basso. I linfociti vengono ulteriormente differenziati mediante il gating delle doppiette e la rimozione dei monociti (CD33⁺) dall’analisi. Infine, aggiungiamo il diagramma temporale come verifica interna della fluidica e della stabilità del sistema durante le analisi sperimentali (Figura 6a).

Un totale di 24 popolazioni, senza limitazioni, è stato valutato qui nei sottogruppi di cellule T. Per iniziare questa analisi, disegniamo una regione sulle cellule CD3⁺ che ricade nella regione di linfociti. Ciò ci consente di separare le cellule T CD4⁺ e CD8⁺ da altri tipi di cellule che potrebbero esprimere questi marcatori, come le cellule NK (CD8) e i monociti (CD4).

Esaminando più approfonditamente i sottogruppi CD4 T, una popolazione di cellule T CD4⁺CD25 comprende le cellule T regolatorie. Poiché questo marcatore è spesso scarsamente visibile e quindi più difficile da sottoporre a gating con fiducia nei pannelli multicolore con un grande potenziale di diffusione dei dati, abbiamo incluso un controllo di fluorescenza meno uno (FMO) per aumentare la fiducia. Con il gating sulle cellule CD4⁺, possiamo anche valutare l’espressione di CCR4 in funzione delle cellule Treg: mentre il marcatore CCR4 svolge un ruolo fondamentale nello spostamento in posizione iniziale delle cellule cutanee, un sottogruppo di CCR4⁺ che pare controlli la soppressione delle cellule T regolatorie effettrici.³

Combinando CD45RA con CCR7 possiamo iniziare a esaminare i vari stadi o i percorsi a cui si sottopongono i sottogruppi di cellule T durante l’attivazione, ovvero cellule naïve (CD45RA+CCR7+), cellule della memoria centrale (CD45RA-CCR7+), cellule della memoria effettrice (CD45RA+CCR7-) e cellule della memoria effettrice (CD45RA-CCR7-). Ciascun fenotipo può essere ulteriormente valutato osservando le varie espressioni delle molecole co-stimolanti CD27 e CD28.

La proteina 1 di morte cellulare programmata (PD-1) è un membro della superfamiglia CD28 ed è responsabile del miglioramento delle cellule T regolatorie, oltre a impedire la funzione effettrice delle cellule T. Infine, CD95 è responsabile dell’apoptosi cellulo-mediata. CD95 è espresso principalmente sulle cellule T della memoria, ma anche una piccola porzione di cellule T con fenotipo naïve esprime CD95 e viene considerata la cosidetta cellula staminale come le cellule T di tipo memoria (Figura 6b).⁴

Esaminiamo i sottogruppi di cellule T CD8, con un approccio simile utilizzato per osservare i sottogruppi di marcatori CD45RA, CCR7, CD28 e CD27 come abbiamo fatto con CD4. Il sottogruppo CD8⁺CD57⁺ denota cellule T differenziate in maniera terminale con elevata capacità citotossica ma bassa capacità proliferativa. L’espressione di CD95 come funzione su CD45RA viene nuovamente valutata in questo sottogruppo di cellule T. (Figura 6c).

Sebbene non siano colorate così intensamente in questo pannello come le cellule T, le cellule B possono anche essere osservate (CD19⁺, CD20, ^HLA-DR+) nel gating sulla popolazione CD3^-. Se si desiderassero maggiori dettagli su questa popolazione o su altri tipi di cellule, i canali aperti nel pannello portante dovrebbero consentire di effettuare le modifiche con facilità. (Figura 6d).

Conclusioni

In questa nota applicativa illustriamo la facilità di utilizzo di analisi con reagenti essiccati e unificati DURAClone come struttura per pannelli di immunofenotipizzazione più profondi. A partire da una struttura portante e con canali aperti su un citometro, si ottengono risultati rapidi e si ha la sicurezza di sapere che molti dei parametri nel pannello sono pre-ottimizzati. Questo metodo consente anche una maggiore flessibilità in laboratorio, poiché è possibile impostare reagenti aggiuntivi per porre domande specifiche sulla ricerca.

Inoltre, l’uso delle provette DURAClone IM riduce il tempo impiegato dal personale per dispensare i reagenti e la possibilità di errore durante il pipettamento di più reagenti in più provette dei campioni.

Infine, la sensibilità dei rilevatori APD in CytoFLEX consente di progettare pannelli flessibili a parametri elevati. I marcatori scarsamente espressi non richiedono più il posizionamento esclusivamente sui canali ad alte prestazioni, come nel caso del posizionamento di CD25 BV786 sul canale V763. Sebbene sia stata eseguita una FMO, è risultata chiaramente visibile la separazione tra CD4⁺CD25^- e CD4⁺CD25⁺, evidenziando la capacità del sistema di distinguere le popolazioni scarsamente visibili da quelle negative.

Protocollo

1. Colorare i controlli di compensazione DURAClone (inclusi nel kit DURAClone).
   1. Posizionare una provetta di controllo di compensazione in un rack.
   2. Aggiungere una goccia di ciascuna delle sfere VersaComp positiva e negativa in ciascuna provetta.
   3. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
   4. Aggiungere 1 ml di PBS + BSA all’1% in ciascuna provetta e centrifugare a 300x g per 6 minuti.
   5. Far decantare il surnatante.
   6. Agitare.
   7. Risospendere in 400 μl di tampone di PBS + BSA all’1%.
2. Creare controlli di compensazione dei reagenti aggiuntivi.
   1. Aggiungere una goccia di ciascuna delle sfere VersaComp positiva e negativa nella provetta.
   2. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
   3. Aggiungere un tampone di 1 ml di PBS + BSA all’1% in ciascuna provetta e centrifugare a 300x g per 6 minuti.
   4. Far decantare il surnatante.
   5. Agitare.
   6. Risospendere in 400 μl di tampone di PBS + BSA all’1%.
3. Preparare il sangue colorato.
   1. Aggiungere 50 μl di tampone di colorazione brillante in ciascuna provetta DURAClone.
   2. Aggiungere le quantità di test titolate di ciascun anticorpo aggiuntivo e iFluor 860 in ciascuna provetta DURAClone.
   3. Etichettare un’ulteriore provetta da 12 x 75 mm come sangue intero non colorato.

ACQUISIZIONE

4. Eseguire l’avvio quotidiano.

a. Eseguire il programma di avvio del sistema CytoFLEX.
b. Verificare la configurazione del rilevatore.

Figura 2. Configurazione del rilevatore di CytoFLEX LX dotato di laser UV.

c. Eseguire la procedura di controllo della qualità secondo il manuale dell’utente: “Istruzioni per l’uso della serie CytoFLEX”, numero documento B49006xx.

5. Creare esperimenti sulla compensazione
a. Per i controlli DURAClone e le aggiunte, includere il numero di lotto per consentire l’aggiornamento dei controlli di compensazione quando i lotti cambiano.
b. Selezionare la sfera nella colonna del tipo di campione per riflettere i controlli a colore singolo.

Figura 3. Finestra di impostazione della compensazione, dove l’operatore può selezionare i canali e il tipo di campione.

c. Deselezionare l’uso di un negativo universale, poiché le sfere VersaComp hanno un picco negativo in ogni provetta.

Figura 4. Esempio di analisi e gating a singolo colore.

d. Registrare ogni campione di compensazione.
i. Spostare il gate di dispersione in modo da contenere singoletti di sfere.
ii. Utilizzare il dispositivo di scorrimento log-lineare per restringere la popolazione negativa e spostare il gate per contenere la popolazione negativa.
iii. Spostare il gate per contenere la popolazione positiva.
e. Calcolare la matrice di compensazione e salvarla nella libreria.

 6. Creare l’esperimento in CytExpert.
a. Importare la libreria di compensazione creata e convertire la matrice in base ai guadagni correnti.
b. Creare i diagrammi.
c. Registrare i dati.

Bibliografia

1. Nguyen R, Perfetto S, Mahnke YD, et al. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A 2013 Mar; 83 (3): 306-315. Disponibile all’URL: 2013 Feb 6; doi: 10.1002/cyto.a.22251.
2. Lawrence W, Varadi G, Entine G, et al. A Comparison of Avalanche Photodiode and Photomultiplier Tube Detectors for Flow Cytometry. Proceedings of SPIE 2008 Feb; Vol 6859. Disponibile all’URL: 2008 Feb; doi: 10.1117/12.758958.
3. Baatar D, Olkhanud P, Sumitomo K, et al. Human Peripheral Blood T Regulatory Cells (Tregs), Functionally Primed CCR4+ Tregs and Unprimed CCR4− Tregs, Regulate Effector T Cells Using FasL. J Immunol 2007 Apr 15; 178(8): 4891-4900.
4. Gattinoni L, Lugli E, Ji Y, et al. A human memory T-cell subset with stem cell-like properties. Nat Med 2011 Sep 18; 17(10): 1290–1297. Disponibile all’URL: doi:10.1038/nm.2446.
5. Van de Veen W, Stanic B, Yaman G, et al. IgG4 production is confined to human IL-10–producing regulatory B cells that suppress antigen-specific immune responses. J ALLERGY CLIN IMMUNOL 2013 APR; 131 (4).
6. Mauri C, Menon, M. The expanding family of regulatory B cells. International Immunology 2015 JUN; 27 (10): 479-486.

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