Processi di coltura anaerobica di batteri probiotici nel microbioreattore BioLector XT

Introduzione

I probiotici sono batteri vivi che si ritiene possano apportare benefici alla salute umana e avere effetti biofunzionali sull'organismo. Vengono comunemente utilizzati per aumentare il numero di batteri desiderabili nell'intestino e per rigenerarne la flora, ad esempio a seguito di trattamenti antibiotici. Questo è uno dei motivi per cui il valore del mercato dei probiotici e degli integratori alimentari probiotici è aumentato notevolmente¹. Il campo di ricerca del microbioma intestinale umano e dei suoi benefici per la salute è particolarmente importante per il settore della nutrizione. Per questo, la ricerca scientifica in materia di tecniche di coltura anaerobica o microaerofila, come la coltura di probiotici in condizioni simili al microbioma, è di fondamentale importanza. La categoria dei probiotici include una serie di batteri anaerobici come il Lactobacillus o il Bifidobacterium. Tra i vari batteri probiotici, i Bifidobatteri sono
tra i più utilizzati e studiati. Questi sono classificati come anaerobi stretti a causa della loro incapacità di respirare ossigeno e di crescere in colture aerobiche², e sono elementi importanti del microbiota intestinale umano dominante.³

Svolgono un ruolo significativo nel controllo del pH attraverso il rilascio di acidi lattici e acetici, che limitano la crescita di molti potenziali batteri patogeni.⁴ Nel tratto intestinale dei neonati allattati al seno, il Bifidobacterium è la specie cellulare predominante. I batteri di questa specie rappresentano oltre l’80% dei microrganismi presenti nell'intestino.^1,5  Le specie conosciute di Lactobacillus sono più di 200. Si tratta dunque del genere più esteso e variegato tra i batteri lattici generalmente riconosciuti come sicuri (generally recognized as safe, GRAS) dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti d’America. I Lactobacilli sono stati ampiamente studiati e utilizzati come colture starter di fermentazione per prodotti lattiero-caseari o probiotici in virtù dei possibili effetti benefici per la salute.⁶

In questa nota applicativa presentiamo una serie di esperimenti di coltura anaerobica, utilizzando ll microbioreattore BioLector XT insieme al coperchio di gassificazione. Il microbioreattore
BioLector XT è un dispositivo da banco per lo screening ad alta produttività delle colture microbiche che consente di effettuare il monitoraggio online dei parametri di coltura più comuni come la biomassa, il valore del pH, la saturazione di ossigeno della fase liquida (OD) e l'intensità della fluorescenza di varie molecole o proteine fluorescenti. Per ottenere un’alta produttività, le
colture vengono effettuate in piastre per microtitolazione in formato standard SBS/SLAS con 48 pozzetti ciascuna, che permettono di effettuare simultaneamente colture in un massimo di 48
batch in un solo microbioreattore BioLector XT. Inoltre, verrà illustrata la semplicità di utilizzo del coperchio di gassificazione del microbioreattore BioLector XT (vedere Figura 1) per effettuare
colture anaerobiche in batch e fed batch dei batteri probiotici Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum e Bifidobacterium bifidum. Uno dei principali vantaggi del coperchio di gassificazione
del microbioreattore BioLector XT è la possibilità di effettuare simultaneamente il feeding e ilcontrollo del pH durante la gassificazione diretta con azoto (ad esempio, 100% N2) della piastra
per microtitolazione con portate comprese tra 5 e 50 ml/min.

Figura 1. Il coperchio di gassificazione del microbioreattore BioLector XT per piastre per microtitolazione microfluidiche

Materiali e metodi

Colture anaerobiche di ceppi di Lactobacillus

Tutte le colture di Lactobacilli (Lactobacillus casei DSM 20011 o Lactobacillus plantarum DSM 20174) sono state effettuate in brodo MRS (Carl Roth, Germania) a una temperatura ambiente di 37°C e in condizioni anaerobiche. Al brodo MRS sono stati aggiunti 0,5 g/l di cisteina-HCl in qualità di agente riducente per il potenziale di redox, riducendo l'O2 molecolare residuo nel terreno colturale. Tutte le precolture sono state realizzate in una beuta da 250 ml. A questo scopo, 20 ml di brodo MRS preparato sono stati inoculati con 1 ml di criocoltura, quindi coltivati per almeno 24 ore in condizioni anaerobiche. La coltura principale è stata poi portata a DO_iniziale=1 in brodo MRS. Le successive colture nel microbioreattore BioLector XT sono state effettuate in una piastra microfluidica a pozzetti tondi NextGen per colture in batch e fed batch a pH controllato. Le colture sono state realizzate a 37°C, 600 giri/min. con controllo dell’umidità attivo. I volumi iniziali dei pozzetti di coltura sono stati impostati a 2.000 μl e i volumi massimi a 2.400 μl. Il monitoraggio online della biomassa (gain 3) e la misurazione del pH (LG1) e dell'ossigeno disciolto (RF)
sono stati effettuati dal microbioreattore BioLector XT. Una panoramica più dettagliata delle condizioni della coltura in fed batch di L. casei sono riportate nella Tabella 1.

Tabella 1. Condizioni della coltura in fed batch per L. casei.

Colture anaerobiche di B. bifidum nel microbioreattore BioLector XT

Tutte le colture di Bifidobacterium bifidum (SinoPlaSan AG, Germania) sono state effettuate in brodo MRS (Carl Roth, Germania) a 37°C e in condizioni anaerobiche. Al brodo MRS sono stati
aggiunti 0,5 g/l di cisteina-HCl in qualità di agente riducente per il potenziale di redox, riducendo l'O₂ molecolare residuo nel terreno colturale. Le precolture sono state realizzate in una beuta da
250 ml. A questo scopo, 20 ml di brodo MRS sono stati inoculati con il contenuto di una capsula, quindi coltivati per almeno 24 ore a 37°C in condizioni anaerobiche. La coltura principale è stata
poi portata a DO_iniziale=1,0 in brodo MRS. Per la coltura principale nei microbioreattori BioLector XT sono state effettuate colture in batch e fed batch a 37°C, 600 giri/min., con controllo dell'umidità attivo, monitoraggio online della biomassa (gain 3), pH (LG1) e DO (RF) effettuati. Una panoramica più dettagliata delle condizioni della coltura in fed batch di B. bifidum sono riportate nella Tabella 2.

Tabella 2. Condizioni della coltura in fed batch per B. bifidum.

Impostazioni di layout nella piastra microfluidica a pozzetti tondi NextGen

Tutte le colture in fed batch sono state effettuate nella piastra microfluidica a pozzetti tondi NextGen (Figura 2).

Figura 2. Illustrazione schematica della piastra microfluidica a pozzetti tondi NextGen

La fila A conteneva 1.900 μl della soluzione nutritiva di glucosio, mentre la fila B conteneva 1.900 μl di agente di regolazione del pH. Nel software BioLector i volumi della pompa sono stati impostati a
0,30 μl per le soluzioni acquose (3 M NaOH) e a 0,16 μl per la soluzione nutritiva più viscosa (500 g/l di glucosio). In tutti gli esperimenti di colture in fed batch, il feeding era attivato a tempo e il profilo di feed è stato impostato su un feed costante con 4 μl/ora. Il controllo del pH è stato impostato sul valore 6,0. Le condizioni anaerobiche per le colture nella piastra microfluidica a pozzetti tondi NextGen sono state ottenute utilizzando il coperchio di gassificazione del microbioreattore BioLector XT, che è stato fissato alla piastra per microtitolazione dopo aver effettuato la preparazione e la sigillatura con una pellicola in silicone sterile permeabile ai gas (F-GPRSMF32-1).

Risultati

Coltura in fed batch di Lactobacillus casei nel microbioreattore BioLector XT

Nella Figura 3 viene illustrato il processo di coltura del Lactobacillus casei in brodo MRS. Nel grafico in alto vengono presentati i segnali online della biomassa e dell'ossigeno disciolto (OD), oltre al volume della soluzione nutritiva aggiunta (500 g/l di glucosio). Nel grafico in basso, i valori online del pH e i relativi volumi di NaOH vengono rapportati alla durata della coltura.

Figura 3. Coltura di L. casei utilizzando il coperchio di gassificazione nel microbioreattore BioLector XT.

In questa fase sono state applicati tre diverse impostazioni di processo: una coltura in batch e due in fed batch. Una con un avvio del feed dopo 7,5 ore e l’altra con un avvio del feed dopo 10 ore. Con una portata continua di 30 ml/min. di N2, l’OD è diminuito costantemente. Dopo 45 minuti è stato raggiunto un OD inferiore al 5%, che è poi diminuito ulteriormente. Dopo 4,5 ore è stato raggiunto un OD inferiore allo 0,5%, che è poi diminuito fino a raggiungere lo 0%. Con l'inizio della fase stazionaria della coltura a circa 6,7 ore, la crescita esponenziale si ferma. A questo punto, il segnale della biomassa era di 42 u.a. in tutti e tre gli approcci di coltura. La coltura in batch si sviluppa ulteriormente e lentamente fino a un massimo di 44 u.a. a 9,5 ore, per poi diminuire costantemente fino a un segnale di biomassa finale pari a 38 u.a. al termine della coltura. Un aumento nel segnale della biomassa è associato all’aggiunta della soluzione nutritiva. Non appena il feed viene avviato, è visibile un aumento del segnale della biomassa. Il segnale finale della biomassa per il processo in fed batch da 7,5 ore era pari a 76,3 u.a., mentre per il processo in fed batch da 10 ore è stato rilevato un segnale finale della biomassa pari a 65,5 u.a. dopo 30 ore. I valori per la soluzione di base aggiunta sono correlati alla crescita. L’aggiunta di 3 M NaOH è stata interrotta
con l’inizio della fase stazionaria, poiché non si è verificata alcuna produzione di acido batterico a causa dell’assenza di crescita. Nel caso di un’aggiunta costante della soluzione nutritiva, la produzione dell’acido è continuata e, per questo motivo, la base si è rivelata ulteriormente necessaria per mantenere il valore di setpoint del pH a 6,0.

In sintesi, questo esperimento dimostra che il microbioreattore BioLector XT è un dispositivo adatto per le colture anaerobiche grazie al coperchio di gassificazione e a una corretta applicazione del controllo del pH e del feeding insieme a una gassificazione anaerobica diretta.

Conferma tecnica e biologica delle condizioni anaerobiche nel microbioreattore BioLector XT

Il mantenimento di condizioni anaerobiche durante l'intero periodo di coltura è un requisito importante nel caso della coltura di organismi sensibili all'ossigeno. Nel seguente esperimento, un sensore esterno di ossigeno (FTM Pst6 Sensor/Fibox 4 trace, PreSens Precision Sensing GmbH, Germania) è stato installato in corrispondenza dello scarico del gas del microbioreattore BioLector XT per confermare la funzionalità tecnica del coperchio di gassificazione del microbioreattore BioLector XT e per verificare la tenuta del coperchio di gassificazione e, quindi, l'atmosfera anaerobica.

Nella Figura 4 sono riportati i dati sperimentali di una coltura in batch di Lactobacillus plantarum (L. plantarum). Nel grafico in alto viene mostrato il segnale online della biomassa (gain 3), mentre nel grafico in basso vengono riportati il segnale online dell'ossigeno disciolto nel brodo di coltura e la concentrazione di ossigeno nel punto di uscita del gas del microbioreattore BioLector XT, il segnale online del pH, oltre al volume aggiunto di NaOH per il controllo del pH.

Dopo un ritardo di 2,86 ore, la crescita esponenziale ha avuto inizio. Il segnale della biomassa finale era pari a 155,865 u.a. (DO600 = 9,01 ± 0,07) dopo 7,96 ore quando è stata avviata la fase stazionaria. Durante la crescita del L. plantarum si è verificata la produzione di acido lattico. Questo aumento della formazione di acido è correlato al volume di NaOH aggiunto per mantenere il pH a 6. Con una portata continua di 30 ml/min. di N2, l’OD è diminuito costantemente. Dopo 39 minuti è stato raggiunto un OD inferiore al 5%, che è poi diminuito ulteriormente. Dopo 4 ore, l’OD è ulteriormente sceso al di sotto dello 0,5%, per poi continuare a diminuire fino a raggiungere lo 0%. Il sensore esterno ha mostrato una concentrazione finale dell’ossigeno pari a 0,029% dopo un periodo di coltura di 16 ore.

Figura 4. Coltura di L. plantarum utilizzando il coperchio di gassificazione nel microbioreattore BioLector XT in replicati biologici.

Con questo esempio di coltura, la funzionalità tecnica è stata confermata, ma il fatto che i Lactobacilli siano in grado di svilupparsi anche in condizioni aerobiche e perfino di metabolizzare l'ossigeno non è una prova sufficiente per la conferma biologica della coltura anaerobica nel microbioreattore BioLector XT. Pertanto, è stato coltivato il Bifidobacterium bifidum, rigorosamente anaerobico. I risultati positivi ottenuti dalla coltura di questo ceppo forniscono la conferma biologica per le colture anaerobiche nel microbioreattore BioLector XT. Nella Figura 5 vengono riportati i dati sperimentali di un batch, oltre a una coltura in fed batch di B. bifidum. Nel grafico in alto, i segnali online della biomassa e il volume del feed aggiunto vengono rapportati alla durata della coltura. Nel grafico in basso vengono invece indicati il segnale online (optodi) di pH e OD, oltre al volume aggiunto di 3 M NaOH e al segnale dell’ossigeno rilevato dal sensore di gas esterno in corrispondenza dello scarico del gas del microbioreattore.

Figura 5. Coltura di B. bifidum utilizzando il coperchio di gassificazione nel microbioreattore BioLector X in replicati biologici.

Dopo un ritardo di 2,4 ore, la crescita esponenziale ha avuto inizio. Per la coltura in batch il segnale della biomassa ha raggiunto un valore finale pari a 147,57 a.u. (DO600 = 8,3 ± 0,57). Rispetto alla coltura in batch è stata osservata una crescita esponenziale estesa. Questo fenomeno è dovuto alla presenza di una maggiore quantità di glucosio nel terreno colturale, poiché il feeding era iniziato già dopo 6 ore. Dopo 23 ore di coltura è stato raggiunto un valore di biomassa massimo di 227,3 u.a. (DO600 = 15,93 ± 0,69) Durante la crescita del B. bifidum si è verificata la produzione di acido lattico e la sua crescita è correlata, come è possibile osservare nella curva dell'aggiunta di NaOH per mantenere il pH a 6. In totale, nel brodo di coltura, sono stati pompati 193,56 μl di 3 M NaOH Con una portata continua di 30 ml/min. di N2, l’OD è diminuito costantemente. I dati sull'ossigeno esterno già illustrati per le prime 16 ore dall'inizio della coltura di L. plantarum (come descritto in precedenza) e di B. bifidum sono stati ottenuti simultaneamente nello stesso ciclo, utilizzando quindi la stessa piastra per microtitolazione, lo stesso coperchio di gassificazione e lo stesso sensore di gas esterno. È possibile osservare che il segnale OD aumenta leggermente a partire dalle 18 ore, un fenomeno che potrebbe essere dovuto alla deriva del segnale tecnicamente condizionata degli optodi dell’ossigeno con una deriva allo 0% di ossigeno pari a < 0,5% O2 al giorno. I dati del sensore esterno di ossigeno hanno mostrato un valore di 0,029% in corrispondenza dell’uscita del gas del microbioreattore BioLector XT dopo 23 ore, confermando che le condizioni della coltura anaerobica sono state mantenute durante l'intero periodo di coltura.

Infine, mostriamo un esperimento di coltura di un organismo anaerobico nel microbioreattore BioLector XT che è andato a buon fine. Utilizzando la tecnologia del chip microfluidico m2p-labs e la gassificazione diretta di azoto tramite il coperchio di gassificazione, è ora possibile effettuare simultaneamente il controllo del pH, il feeding e la gassificazione diretta di azoto in modo molto più semplice anche nelle colture su piccola scala.

Conclusioni

In sintesi, mostriamo la conferma tecnica e biologica della coltura di probiotici come i Lactobacilli e il Bifidobacterium bifidum nel microbioreattore BioLector XT utilizzando il coperchio per la gassificazione anaerobica. Utilizzando la tecnologia del chip microfluidico di m2p-labs e la gassificazione diretta di azoto della piastra per microtitolazione attraverso il coperchio, è ora possibile effettuare simultaneamente il controllo del pH, il feeding e la gassificazione diretta di azoto anche nelle colture su piccola scala. Si tratta di un sistema indicato per la coltura di batteri anaerobici.

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