Sistemi ottici usati per la AUC

Le misurazioni di base fornite dalla AUC sono distribuzioni a concentrazione radiale o scansioni, acquisite a intervalli che vanno da alcuni secondi (per la sedimentazione di velocità) ad alcune ore (per la sedimentazione all’equilibrio). Mentre il rotore gira, le scansioni vengono generate quando la cellula passa attraverso un percorso del rilevatore ottico. 

I sistemi ottici attualmente utilizzati per l'AUC comprendono spettrofotometri di assorbanza e interferometri Rayleigh. 

Sistemi ottici Diagramma AUC

Le scansioni vengono generate quando una cellula passa attraverso il percorso di un rilevatore ottico.

 

Spettrofotometria ad assorbanza

Il rilevatore usato più di frequente per la AUC, un sistema ottico ad assorbanza (vale a dire uno spettrofotometro a doppio raggio) è considerato il più facile da usare. La sensibilità maggiore dell’ottica ad assorbanza permette l’esame di campioni in concentrazioni troppo diluite per l’ottica a interferenza. 

Il processo di base per ottenere una scansione per assorbanza include quattro fasi:

Illustrazione: esiste un diagramma relativo a ciò o ne dobbiamo creare uno da usare qui?

1. Una lampada con lampo allo xeno ad alta intensità, che permette di usare lunghezze d’onda da 190 a 800 nm, si attiva per breve tempo mentre un settore selezionato passa nel percorso del rilevatore. 
2. Cellule e singoli settori vengono esaminati a rotazione, con informazioni di durata fornite da un magnete di riferimento nella base del rotore. 
3. Una fenditura al di sotto del campione si muove per permettere la campionatura di diverse posizioni radiali.  

 

Ottica a interferenza Rayleigh

Questa tecnica si basa sul principio che la velocità della luce diminuisce mentre passa attraverso una regione con indice di rifrazione maggiore. Con l’ottica a interferenza usata per la AUC, una luce monocromatica passa attraverso due fessure parallele fini, una al di sotto di ogni settore di una cellula a settore doppio. Una cellula contiene un campione di soluzione e l’altra contiene un campione di solvente in equilibrio di dialisi. 

Le onde luminose che fuoriescono dalle fessure di entrata e passano attraverso i due settori sono sottoposte a interferenza per produrre una banda di “frange” di luce e di buio che si alternano. Quando l’indice di rifrazione nel settore del campione è maggiore che nel riferimento, l’onda del campione viene intralciata rispetto all’onda di riferimento. Ciò causa lo spostamento della posizione delle frange in verticale proporzionalmente alla differenza di concentrazione relativa a un punto di riferimento.

Poiché il segnale proveniente da un sistema ottico a interferenza non si basa su un cromoforo, i composti incolori (ad es. polisaccaridi e lipidi) possono essere caratterizzati dall’AUC. Infatti qualsiasi materiale con un indice di rifrazione differente da quello di riferimento contribuirà a un segnale di interferenza.  

A differenza del sistema ad assorbanza, il segnale di interferenza presenta un disturbo stocastico molto ridotto. Uno stress sui componenti ottici, tuttavia, può portare a modifiche dell’indice di rifrazione, pertanto con un sistema ottico a interferenza devono essere usate sempre finestre in vetro zaffiro. Sono inoltre necessari un allineamento e una messa a fuoco precisi per ottenere risultati accurati dall’ottica a interferenza, ma dopo essere state allineate e messe a fuoco correttamente le ottiche a interferenza rimangono stabili per un periodo di tempo prolungato.

 

Immagine AUC di Rayleigh

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