Sette suggerimenti per ottenere il pannello perfetto per la citometria a flusso multicolore

Con pannelli ben progettati e reagenti di alta qualità, la citometria a flusso multicolore è un potente strumento per rilevare e monitorare più parametri del campione contemporaneamente.  Tuttavia, la qualità dei dati dipende in larga misura dall'ottimizzazione del design del pannello e dalla corretta regolazione della strumentazione.  Questi 7 suggerimenti possono aiutarvi a migliorare la qualità dei dati relativi alla citometria a flusso ed evitare le comuni trappole della citometria a flusso multicolore.

1. Selezione del fluorocromo

I coloranti non sono tutti uguali.  Alcuni coloranti sono estremamente brillanti, mentre altri, al confronto, sono molto tenui.  Tuttavia, scegliere il colorante più brillante non è sempre l'idea migliore e non sempre è prudente evitare un colorante più tenue.  In generale, è consigliabile utilizzare un colorante sufficientemente brillante da rilevare l'antigene di interesse, causando al contempo il minimo spillover o scarico in altri rivelatori. Lo spillover si verifica quando lo spettro di emissione di un fluorocromo viene rilevato da un rivelatore impostato per misurare l'emissione di un diverso fluorocromo, contribuendo così a un segnale indesiderato nel canale del secondo fluorocromo. Un'emissione più brillante significa un maggiore potenziale di spillover e una maggiore diffusione dei dati, che può portare a una perdita di risoluzione. Per evitare ciò, utilizzate coloranti più brillanti per gli antigeni scarsamente espressi e, al contrario, utilizzate coloranti più tenui per gli antigeni fortemente espressi. Seguire questa regola vi permetterà di razionalizzare i vostri coloranti.



2. Selezione del canale

Ammettiamolo, lo spillover è inevitabile, ma è comunque possibile ottimizzare la selezione dei coloranti per il pannello. Scegliete fluorocromi con influenza ridotta su altri canali per gli antigeni fortemente espressi (colonne verdi), assegnando gli antigeni scarsamente espressi ai fluorocromi il cui canale di rilevazione è solo leggermente influenzato da spillover di altri fluorocromi (righe gialle). Il fatto che un fluorocromo rientri in una delle categorie riportate sopra dipende dalla configurazione dello strumento e dalla scelta dei fluorocromi. Assicuratevi di testare le combinazioni di fluorocromi e canali per trovare la combinazione migliore per il vostro pannello.  

Può essere difficile evitare gli spillover quando si progettano esperimenti che fanno uso di tutti i canali disponibili, ma questi suggerimenti possono aiutarvi a ridurre l'impatto che lo spillover avrà sul vostro pannello e sui dati risultanti.  



3. Esclusione dell’antigene

Cosa sarà mai un piccolo spillover tra antigeni che si escludono a vicenda?  Lo spillover tra gli spettri di emissione di due antigeni non interferirà con il vostro pannello se gli antigeni non sono espressi insieme sulle stesse cellule nella porta cellulare di interesse.



4. Co-espressione antigenica

Se un marcatore tipicamente o potenzialmente ha una densità di espressione modulata o debole, si dovrebbe cercare di ridurre lo spillover dalle etichette dei fluorocromi degli antigeni co-espressi nel canale di questo marcatore, in quanto lo spillover può occludere i dati e mascherare le potenziali modulazioni. Solo lo spillover delle etichette dei fluorocromi degli antigeni non coespressi è sicuro e non influisce sulla sensibilità e la risoluzione per gli antigeni modulati o scarsamente espressi. 




5. Genitore-discendente

Rispondere ai genitori non è sempre una cosa negativa?  Per i pannelli di citometria a flusso multicolore, i discendenti che rispondono ai genitori possono preservare la sensibilità tra i marcatori.  Traduzione: è possibile consentire a un marcatore di sottoinsieme o sottopopolazione (discendente) di rovesciarsi o di incrociarsi con il marcatore di gating (genitore).  Il marcatore genitore tollererà questo spillover, poiché il discendente sarà sempre positivo per il marcatore genitore.  Ad esempio, se CD4 mostra un forte spillover nel canale CD3 all'interno di un gate dei linfociti, la diffusione dello sfondo non causerà la diffusione dello sfondo nel canale CD3 perché le cellule T CD4+ sono anche CD3+.  Fate attenzione alle condizioni di inversione, dove il marcatore genitore ha una diafonia con il marcatore discendente, perché lo spillover del segnale genitore contaminerà lo sfondo del segnale discendente. 



6. Soglia positiva

Lo spillover in un antigene co-espresso è ammissibile se l'obiettivo è solo quello di identificare le cellule brillantemente positive o di discriminare tra espressione luminosa e medio-forte/tenue. Tuttavia, lo spillover non può essere tollerato quando l'obiettivo è quello di discriminare solo tra espressione tenue e negativa, in quanto questo offuscherà i vostri dati e le vostre conclusioni, determinando falsi positivi. 



7. Complessità di spillover

Dimenticate la complessità e cercate di mantenere i modelli di spillover il più possibile semplici e diretti per evitare limiti di rilevamento dipendenti dal fenotipo.  Ricordate, tuttavia, che ci saranno spillover e diffusione da fluorocromi non visualizzati nel vostro diagramma a punti, quindi il mantenimento della semplicità potrebbe risultare piuttosto complicato.
 




Quando pianificate la prossima prova di citometria a flusso multicolore, ricordate questi 7 suggerimenti e il pannello vi ricompenserà con un rilevamento ottimale del segnale e una maggiore certezza dei risultati con una ridotta complessità. Per migliorare ulteriormente le vostre probabilità di successo con la citometria a flusso multicolore, utilizzate reagenti robusti e di alta qualità che sono stati sottoposti al controllo degli enti preposti e degli standard di produzione. 

Più affidabili saranno i vostri reagenti, più affidabili saranno i vostri dati.
 

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