L’AUC nel XXI secolo: la nuova analisi di Ole Lamm
All’inizio del XXI secolo, probabilmente lo sviluppo più importante relativo all’AUC riguardava più la matematica che la scienza degli esperimenti sulla velocità di sedimentazione.
Mentre Svedberg è stato colui che è balzato agli onori della cronaca per quanto riguarda la costruzione della prima ultracentrifuga analitica, il vero responsabile dell’ideazione di una modalità di analisi dei dati sulla velocità di sedimentazione è stato uno studente di dottorato di Svedberg, proveniente da Göteborg, Svezia.
Il suo nome era Ole Albert Lamm.
Nel 1929, dedusse un’equazione generale in grado di descrivere il comportamento del limite mobile in un campo ultracentrifugo. Più specificamente, la sua equazione, che in seguito avrebbe preso il suo nome, descriveva la distribuzione della concentrazione dei soluti risultante dalla sedimentazione e dalla diffusione sotto ultracentrifugazione in tipiche celle con struttura a settori.
Grazie a Lamm, l’analisi della sedimentazione potrebbe essere descritta usando una singola equazione (differenziale). Purtroppo, l’equazione di Lamm non può essere risolta direttamente nel caso generale. La soluzione esatta è una serie infinita di integrali, che può essere calcolata solo tramite integrazione numerica.
Dalla deduzione dell’equazione di Lamm nel 1929 e per la maggior parte del 20° secolo, la mancanza di una soluzione analitica esplicita ha ostacolato l’analisi della velocità di sedimentazione (SV) e limitato le configurazioni sperimentali.4
Con l’aumento dell’uso dell’AUC, tuttavia, l’equazione di Lamm è stata risolta analiticamente, per specifici casi limite, da scienziati come Hilding Faxén, W.J. Archibald e, più recentemente, da Hiroshi Fujita. Ma l’avvento del 2000 ha segnato anche l’epoca d’oro dei computer, un’era che Svedberg e Lamm potevano solo immaginare.
I calcolatori non avevano più le dimensioni di un frigorifero e, nelle case di tutto il mondo, i “personal computer” erano ormai diffusi tanto quasi quanto i televisori. E con l’introduzione del software che permetteva l’uso del fitting diretto dell’equazione di Lamm per l’analisi dei dati SV,15 l’enorme potenziale dell’equazione di Lamm poteva finalmente realizzarsi.
Uno di questi software era SEDFIT, sviluppato da Peter Schuck e colleghi, in grado di generare rapidamente e con precisione soluzioni dell’equazione di Lamm per il fitting dei dati SV.16
Insieme ad altri programmi, SEDFIT ha generato nuove strategie e applicazioni sperimentali4, e ha permesso di rilevare, quantificare e caratterizzare quantità minime di contaminanti in soluzione.16
I metodi di analisi precedenti erano problematici quando si lavorava con molecole di dimensioni estremamente ridotte (peso molare < 3.000) ed estremamente grandi (peso molare > 10.000.000). L’introduzione di questi nuovi programmi software ha eliminato entrambe queste limitazioni, rendendo possibile, per esempio, ottenere informazioni utili sull’associazione di piccoli peptidi e sull’eterogeneità e aggregazione dei virus.
Solo pochi anni dopo, alcune delle più recenti soluzioni software per l’AUC erano in grado di analizzare i dati combinati di diversi esperimenti, compresi i dati acquisiti con diversi metodi di primo principio. Inoltre, altri programmi basati su principi primi termodinamici erano disponibili per analizzare i dati relativi all’equilibrio di sedimentazione (SE).17,18
L’AUC e la ricerca biofarmaceutica
Durante i primi due decenni di questo secolo, l’AUC si è dimostrata utile per molte nuove applicazioni e settori (ad esempio, i nanoprodotti, come quelli usati nei cosmetici e gli agenti di contrasto biologicamente inerti).19
Ma uno degli usi più importanti e dalla portata più vasta dell’AUC è stato nel settore biofarmaceutico, in continuo sviluppo.
In combinazione con i nuovi programmi di software analitico, l’AUC è diventata un potente strumento per aiutare gli scienziati biofarmaceutici a valutare il livello totale di aggregazione di un farmaco, a caratterizzare la sua eterogeneità e la consistenza della struttura di ordine superiore della sua forma monomerica e a misurarne proprietà biofisiche in soluzione.11
Non solo può fornire informazioni indipendenti sulla quantità e sulla distribuzione dimensionale degli aggregati nei campioni biofarmaceutici nel buffer di formulazione, senza praticamente alcuno sviluppo del metodo ma, poiché utilizza principi diversi dalla cromatografia a esclusione dimensionale (SEC), l’AUC evita i problemi che possono influenzare negativamente i risultati SEC.
Inoltre, l’AUC è in grado fornire queste informazioni durante le fasi iniziali dello sviluppo del farmaco, prima ancora che sia pronto un metodo SEC funzionante. Di conseguenza, può aiutare a garantire che il metodo SEC utilizzato fornisca informazioni significative sull’aggregazione, anche se il buffer di formulazione del campione e la fase mobile SEC differiscono.11
In termini di dimensioni delle particelle, l’AUC è molto più versatile rispetto alla SEC, quindi può essere utilizzata per caratterizzare i biofarmaci che vanno dai piccoli peptidi alle grandi particelle proteiche come i virus, le particelle virus-simili o le nanoparticelle utilizzate nei sistemi di rilascio dei farmaci per le terapie geniche.
Molte di queste nuove terapie rivoluzionarie sono focalizzate alla lotta di alcune delle forme più diffuse e letali di cancro, come quelle che colpiscono il pancreas, il seno, il colon, i polmoni e la prostata. Ma questo è solo l’inizio.
Altrettanto entusiasmante è l’applicazione dell’AUC alle terapie basate sugli anticorpi, dove è già considerato un gold standard, e ai sistemi terapeutici basati su vaccini glicoconiugati e DNA, così come alle terapie macromolecolari per numerose condizioni, dalle allergie all’obesità.20
È difficile sottolineare a sufficienza l’importanza della tecnologia AUC per il mondo odierno.
Oggi, con la potente combinazione tra hardware (grazie a Svedberg, Pickels, Beckman e altri), e software (grazie a Lamm, Fujita e successivamente a Schuck e ai suoi colleghi), l’AUC è diventato uno strumento insostituibile per la ricerca macromolecolare nel XXI secolo.
Arnold Beckman è purtroppo venuto a mancare nel 2004 all’età di 104 anni, ed è riuscito a vedere solo i primi frutti dell’impatto derivante da questa potente fusione di ingegneria e programmazione informatica.
Howard Schachman è stato invece in grado di assistere a molto di più dell’ultima evoluzione della tecnologia alla quale aveva dedicato la maggior parte della sua carriera e gran parte della sua vita. Si è spento all’età di 97 anni, nel 2016.
Per coincidenza, quello fu lo stesso anno in cui Beckman Coulter Life Sciences ha presentato al mondo la sua ultracentrifuga analitica all’avanguardia, Optima AUC, che Schachman avrebbe certamente amato.
Optima AUC: la nascita di un nuovo standard
Beckman Coulter Life Sciences ha recentemente contribuito a riportare l’AUC al centro della ricerca sulle proteine e della caratterizzazione delle macromolecole introducendo L’Optima AUC di nuova generazione.
Con velocità di scansione più elevate, una maggiore precisione della lunghezza d’onda e una migliore risoluzione dei dati, l’Optima AUC fornisce agli scienziati risposte più accurate a ogni analisi. Con una velocità del rotore fino a 60.000 giri/minuto, i tassi di acquisizione dei dati sull’Optima AUC sono quasi cinque volte superiori rispetto al ProteomeLab XL-A/XL-I, con una risoluzione radiale tre volte superiore, in grado di poter generare quasi 15 volte più dati.
Optima AUC fornisce attualmente sistemi ottici di assorbanza e/o interferenza, con la possibilità di installare fino a tre sistemi di rilevamento indipendenti e simultanei. A differenza di ProteomeLab XL-A/XL-I, tuttavia, tutte le ottiche del sistema sono contenute all’esterno della camera del rotore, rendendo più facile la manutenzione di Optima AUC.
Un display touchscreen da 15” (38 cm) indica la progressione dei progetti sperimentali. Le capacità di monitoraggio remoto consentono ai ricercatori di configurare, monitorare ed estrarre i dati dell’esperimento praticamente da qualsiasi posizione.
Compatibile con le stesse celle, rotori e software utilizzati con ProteomeLab XL-A/XL-I, Optima AUC supera altre caratteristiche del suo precursore in termini di risoluzione dell’immagine e il numero di frange di interferenza per cella che può catturare.
Oggi viviamo in un mondo iperconnesso. Quindi non sorprende che il nuovo Optima AUC permetta ai ricercatori di monitorare i propri esperimenti da qualsiasi luogo del mondo che offra un accesso a Internet.
Il futuro dell’AUC potrebbe ora essere realmente senza limiti.
4Schuck P. Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation: discrete species and size-distributions of macromolecules and particles. Boca Raton (FL): CRC Press; 2016.
11 Berkowitz SA, Philo JS. Characterizing biopharmaceuticals using analytical ultracentrifugation. In: Houde DJ, Berkowitz SA, editors. Biophysical characterization of proteins in developing pharmaceuticals. Waltham (MA): Elsevier; 2015.
15 Schuck P. Sedimentation analysis of noninteracting and self-associating solutes using numerical solutions to the Lamm equation. Biophys J 1998;75:1503–1512.
16 Laue T. Analytical ultracentrifugation: a powerful ‘new’ technology in drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies 2004;1(3):309-315.
17 Johnson ML, Correia JJ, Yphantis DA, et al. Analysis of data from the analytical ultracentrifuge by nonlinear least-squares techniques. Biophys J 1981;36:575–588.
18Vistica J, Dam J, Balbo A, et al. Sedimentation equilibrium analysis of protein interactions with global implicit mass conservation constraints and systematic noise decomposition. Anal Biochem 2004;326:234–256.
19Kaur IP, Kakkar V, Deol PK, et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release 2014;193:51-62.
