Gli anni ’80 e ’90: affrontare le forze di attrito

La forza di attrito indica la forza generata da due superfici che entrano in contatto e scivolano l’una contro l’altra; l’intensità di questa forza è influenzata dalla struttura della superficie, dall’angolo e dalla posizione, così come dalla quantità di forza che le spinge all’unisono.

Nonostante il suo comprovato valore per la comunità di ricerca, compreso il costante appoggio di scienziati estremamente rispettati come Howard Schachman dell’Università dell’University of California a Berkley, l’AUC ha cominciato a perdere molto del suo splendore all’inizio degli anni ’80.

Ad esacerbare questo problema c’erano tre “forze d’attrito”.

In primo luogo, vi era una crescente convinzione che l’AUC fosse troppo difficile da eseguire per molti esperimenti di routine, e che fosse invece preziosa solo per sistemi altamente purificati e unicamente per i ricercatori che cercavano una profonda comprensione a livello chimico di una soluzione.¹⁶

Di conseguenza, molti biochimici e biologi molecolari hanno iniziato a determinare i pesi molecolari usando tecniche più semplici e meno costose come la cromatografia a permeazione di gel e l’elettroforesi di gel. La cristallografia e la risonanza magnetica nucleare (NMR) stavano allora iniziando a riscuotere maggiore attenzione a discapito dell’AUC.⁹ Infatti, non era insolito che i libri di testo pubblicati negli anni ’80 stralciassero completamente i capitoli dedicati all’argomento dell’ultracentrifugazione analitica.

I suoi sostenitori affermavano che l’AUC era più facile da eseguire rispetto ad altri metodologie di routine della biologia molecolare e che forniva informazioni complete e di facile comprensione circa le molecole in soluzione, anche senza un’analisi quantitativa dettagliata. Un limite inaspettatamente veloce o lento, per esempio, poteva permettere l’intuizione necessaria per interpretare risultati incerti ottenuti da altri metodi sperimentali.¹⁶

La seconda forza di attrito era strettamente legata alla prima.

Nonostante il lavoro innovativo condotto da Fujita nei due decenni precedenti, l’analisi delle enormi quantità di dati generati dall’AUC era ancora un’impresa complessa e dispendiosa in termini di tempo. Estrarre i coefficienti di sedimentazione, i coefficienti di diffusione traslazionale, i coefficienti di attrito e la massa galleggiante dai dati sulla velocità di sedimentazione risultava difficile, in particolare da miscele complicate, poiché non esistevano ancora soluzioni semplici all’analisi dell’equazione di Lamm. ¹⁶

In terzo luogo, l’interesse generale per la chimica biofisica dei biopolimeri aveva cominciato a scemare a favore degli sviluppi emergenti della biologia molecolare e della tecnologia ricombinante.¹¹

Se gli anni ’50 fino agli anni ’70 hanno rappresentato un periodo di “boom” per l’AUC, sembrava che tutto questo stesse per finire.

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In realtà, non ci volle molto perché fosse chiaro che l’ultracentrifuga analitica non era destinata a subire lo stesso destino del telefono a disco rotante e del nastro a otto tracce.

A metà degli anni ’80, era evidente che la NMR o spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (in modalità ad alta risoluzione) e la cristallografia potevano essere applicate solo a un numero limitato di macromolecole biologiche. Inoltre, le tecniche di filtrazione del gel e di elettroforesi del gel avevano dimostrato di essere molto meno affidabili dell’AUC per ottenere pesi molecolari precisi, di fondamentale importanza per valutare la composizione delle subunità di gruppi di macromolecole.⁹

Ironicamente, negli anni ’90, alcuni degli stessi progressi nella biologia molecolare e nella biotecnologia che sembravano sul punto di relegare l’AUC nella discarica della storia scientifica, come la ricerca sulle proteine bioterapeutiche, richiedono una comprensione ancora più rigorosa delle interazioni fisiche di biopolimeri e nanoparticelle.

Come risultato, l’interesse per l’AUC ha cominciato a tornare in auge.

Questo “rinascimento dell’AUC” ha subito un’accelerazione nel 1992 con l’introduzione di una nuova ultracentrifuga analitica rivoluzionaria di Beckman Instruments: la XL-A (ora chiamata ProteomeLab XL-A e prodotta da Beckman Coulter Life Sciences).

Con tutta la potenza analitica di una Spinco Model E, e con un design ispirato alla Model L, la XL-A era compatta e facile da usare. A differenza dei modelli precedenti, la velocità del rotore, la temperatura e l’acquisizione dei dati erano stati tutti computerizzati.

Ora, gli esperimenti che duravano da diverse ore a molti giorni potevano essere eseguiti con un intervento minimo da parte dell’operatore e i dati potevano essere visualizzati e analizzati in tempo reale mentre l’esperimento procedeva.¹²

Ripensando ai giorni in cui Howard Schachman chiamava Ed Pickels alla Spinco per suggerire migliorie, la XL-A disponeva di un sistema ottico di assorbanza e di un monocromatore a scansione che permetteva di misurare la concentrazione del campione a lunghezze d’onda da 190 a 800 nm.

Al ProteomeLab XL-A furono aggiunte successivamente le ottiche di interferenza di Rayleigh, creando uno strumento (il ProteomeLab XL-I) che poteva registrare simultaneamente i dati con entrambi i tipi di sistemi ottici.

Come Schachman e Pickels avevano imparato decenni prima, ogni sistema ottico ha specifici vantaggi e svantaggi. Le ottiche ad assorbimento sono particolarmente utili per gli esperimenti che coinvolgono gli acidi nucleici e per il rilevamento di qualsiasi macromolecola contenente cromofori forti.

Al contrario, il sistema ottico a interferenza è di gran lunga migliore per l’analisi di macromolecole prive di cromofori intensi (ad esempio, polisaccaridi), nonché di campioni che contengono componenti tampone fortemente assorbenti. È anche il sistema ottico preferito per la caratterizzazione di campioni altamente concentrati.

Indipendentemente dal sistema ottico utilizzato, le ultracentrifughe XL-A e XL-I hanno rappresentato un progresso straordinario nella storia dell’AUC.

Negli anni ’60, misurare i pesi molecolari e caratterizzare i modelli di associazione per una semplice proteina che si auto-associa poteva richiedere diverse settimane, anche nel laboratorio più attrezzato. Ora tali misurazioni potrebbero essere effettuate di routine in pochi giorni.

Così, invece di essere considerata un metodo antiquato, l’AUC negli anni ’90 stava diventando la metodologia preferita per mettere in luce una serie crescente di proprietà delle macromolecole in soluzione, tra cui:

• Dimensioni
• Distribuzione delle dimensioni
• Purezza
• Conformazione lorda
• Non idealità termodinamica (compresi i coefficienti viriali e di attività)
• Costanti di equilibrio per l’autoassociazione
• Legame del ligando e legame ad altre macromolecole
• Stabilità dei complessi macromolecolari
• Meccanismi di autoassemblamento
• Caratterizzazione della struttura dei gel e delle strutture di rete macromolecolari
  
   

La tecnologia concepita da Théodor Svedberg negli anni ’20, perfezionata da Beams e Pickels negli anni ’40 e su cui ha investito il visionario Arnold Beckman negli anni ’50, stava di nuovo dando un serio contributo alla ricerca sulle scienze della vita in tutto il mondo.

Beh, per lo più serio.

Fu anche in questo periodo che lo spasimante di lunga data dell’AUC, Howard Schachman, allora un rispettato biochimico ricercatore e professore della scuola di specializzazione della University of California a Berkeley, trovò un modo interessante per dimostrare ciò che stava imparando dall’AUC sulla stabilità di dimeri e trimeri.

Secondo Schachman, che era noto per il suo malizioso senso dell’umorismo, i suoi “modelli di primate” divennero una parte particolarmente popolare della letteratura dell’epoca e furono ampiamente discussi nella lezione che tenne per la Harvey Society presso la Rockefeller University. ¹⁴

Non fu una delle scimmie di Schachman, tuttavia, a guidare il successivo e sostanziale progresso dell’AUC.
Fu un Lamm.

⁹ Harding SE. Analytical Ultracentrifugation and the genetic engineering of macromolecules. Biotechnol Genet Eng Rev 1993;11:317-356.
¹²Cole JL, Hansen JC. Analytical Ultracentrifugation as a contemporary biomolecular research tool. Journ Biomolec Tech 1999;10:163–176.
¹⁴ Howard Schachman, “University of California Professor of Molecular Biology: Discussions of His Research Over His Scientific Career From the 1940s Until 2010,” conducted by Sondra Schlesinger between 2007 and 2010, Regional Oral History Office, The Bancroft Library, University of California, Berkeley, 2010.
¹⁶ Laue T. Analytical ultracentrifugation: a powerful ‘new’ technology in drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies 2004;1(3):309-315.