Caratterizzazione del vettore virale

La terapia cellulare e genica prevede l’utilizzo di un veicolo di somministrazione genetica per introdurre un elemento terapeutico nell'organismo. Molte aziende di terapie genetiche stanno lavorando con virus adeno-associati (Adeno-Associated Virus, AAV) come loro veicolo scelto per la somministrazione di materiale genetico. Gli AAV sono ideali perché i capsidi virali possono essere modificati per trasportare un carico terapeutico. I ricercatori devono prima stabilire quale percentuale dei loro capsidi virali sono intatti, poi devono capire quanti capsidi virali intatti sono pieni. Questo carico transgenico è fondamentale per il successo della terapia.

 

È particolarmente importante per i ricercatori comprendere il carico virale di queste particelle perché è improbabile che le particelle virali che non contengono il gene terapeutico bersaglio completo producano attività terapeutica; questi capsidi parziali potrebbero produrre invece reazioni avverse, quali una risposta immunogenica. I ricercatori devono comprendere la qualità e la purezza di una data preparazione virale, e molti si stanno rivolgendo alla ultracentrifugazione analitica per ottenere queste informazioni.

La soluzione per misurare l’omogeneità, la purezza (e altro) del vettore rAAV: analizzare particelle virali in soluzione.

I vettori virali adeno-associati ricombinanti (recombinant Adeno-Associated Viral Vector, rAAV) potrebbero riservare grandi sorprese per le nuove terapie genetiche salvavita.

Ma mentre le tecniche classiche, come la dispersione dinamica della luce (Dynamic Light Scattering, DLS) o la cromatografia liquida ad alta prestazione (High Performance Liquid Chromatography, HPLC), possono caratterizzare l’eterogeneità e l’aggregazione dei rAAV, esse non possono semplicemente fornire una risoluzione sufficiente per quantificare l’omogeneità e il carico delle particelle virali. Quando si tratta di produrre preparazioni di vettori rAAV di qualità clinica, l’ostacolo più grosso è sempre stato ottenere misurazioni ad alta risoluzione.

Come sanno bene i ricercatori della terapia genica, con una tale posta in gioco nelle prime fasi di sviluppo del prodotto, agire in fretta è fondamentale. L’adozione dell’ultracentrifugazione analitica rende possibile la produzione di vettori rAAV di qualità clinica, a differenza delle altre solite tecnologie. 

 

Il principale ostacolo? Mancanza di una tecnica quantitativa ad alta risoluzione per il monitoraggio della qualità tecnica con riguardo a:

  • Omogeneità
  • Purezza
  • Uniformità del prodotto
  • Pienezza virale 

 

La soluzione ideale: analisi in soluzione con ultracentrifugazione analitica (AUC).

Come hanno scoperto gli scienziati, ad esempio quelli di Genethon, consentendo analisi esenti da matrici di preparazioni di vettori rAAV - indipendentemente dal sierotipo e dal transgene - l’AUC li aiuta a:

  • Stabilire lo stato o l’omogeneità dell’assemblaggio virale 
  • Quantificare empiricamente l’aggregazione
  • Determinare la contaminazione delle sottoparticelle
  • Quantificare la massa per misurare con precisione il corredo genetico

Visualizzare questo webinar per apprendere come Christine Genethon LE BEC e il suo team hanno utilizzato l’AUC per riuscire a caratterizzare vettori di virus adeno-associati con auto-complementarietà (scAAV) e di virus adeno-associati a singolo filamento (ssAAV), inclusi omogeneità e carico di particelle virali.

Product for Characterizing Viral Vectors

Optima AUC

L’AUC di prossima generazione frequentemente utilizzata nella QC dei vettori virali fornisce la relativa quantità/percentuale di capsidi vuoti, pieni e parziali.

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Analytical Methods to Measure Empty and Full AAV Particles

 

As gene therapy approaches usually require large amounts of AAV vectors for clinical use, few manufacturing processes have been reported to provide high titer and potent quantities of products. The dose control of AAV vectors is commonly established on titration methods relying either on the quantitation of DNA (viral genome) or transgene expression following cell transduction (infectious genome). However, AAV vector lots are generally a heterogeneous mixture of empty particles (i.e. do not contain DNA) and full particles (i.e. contain DNA). Therefore, it could be considered that empty particles are product related impurities, which can impact on the immunogenicity profile of the product when high doses are administered to patients. Different indirect methods can be used to establish the ratio between full and empty AAV particles. The quantification of full capsids is performed by using qPCR based technology. The total particles can be evaluated by an ELISA assay, spectrometric analysis, ion-exchange chromatography or SDS-PAGE. However, these methods have limitations and are not applicable to all serotypes without performing a new development. Using analytical ultracentrifugation approach, we have developed a method to quantify simultaneously empty and full AAV particles as well as intermediate species containing fragmented or incomplete vector genome. We have applied this technique to AAV lots of different serotypes, several sizes of transgene and different process of production. Several examples of AAV vectors analysis will be presented showing that AUC could be implemented as a routine test to monitor AAV product quality and manufacturing consistency.